- 文献综述
2.1 选题的科学意义和应用前景
内膜蛋白(IMPs)在基因组测序中占据开放阅读框架的三分之一1，在所有细胞活动中扮演着相当重要的角色，比如细胞内和细胞间的通讯和分子传递。正因为它在多种细胞功能中占据中心地位，IMPs在疾病2,3,4和药物5,6,7研发方面具有重要的意义。然而，因为缺少大量表达和提纯的方法，而且从母体膜环境中提取出来的IMPs是不稳定的，该蛋白重要功能的研究受到阻碍。如今，我们能够提供一种技术，这种技术指在不需要去污剂和不导致IMPs变性的情况下，在体内溶解构象相同的IMPs，这种技术叫做SIMPLEx （IMPs的可溶性和大量表达）。通过简单的融合IMP和截断载脂蛋白A-I可得到可溶性蛋白，该蛋白可以在活细胞中直接表达。载脂蛋白A-I（ApoAI*）作为一种两亲性蛋白质的盾，它将IMP和水隔绝并提高其溶解性，该技术使蛋白大量表达并对其有增溶效果。通过这项技术可得到大量的膜蛋白，便于进行蛋白功能和结构分析。并且增溶蛋白在药物研发和疾病方面有很大的贡献，故这项技术具有非常重要的意义。
2.2 研究课题背景情况简介
大多数IMPs丰度是很低的8,9，必须通过重组系统大量生产。在细菌、酵母菌、昆虫细胞和无细胞系统中，化学性质相似和构象均匀的IMPs不能大量表达，表达量太低而不能支持功能和结构的研究，并且容易造成聚集和沉淀问题，这种局限可以通过蛋白质工程克服。蛋白质工程是指在目的基因序列中嵌入其他的基因序列，得到融合蛋白，融合部分可以提高目的蛋白的可溶性和产率10，并且不改变目的蛋白的活性。两亲性蛋白质拥有亲水性和疏水性的表面，它可以和脂质联合作为膜的锚或者在它们的传递中作为水溶性粒子。融合IMP和ApoAI*得到可溶性蛋白，该蛋白可以在活细胞中直接表达，并得到较高的产率。为了溶解EmrE蛋白，我们将ApoAI*融合到EmrE蛋白的碳末端，同时引进一个高溶解性的蛋白质，被叫做外表面蛋白A（OspA)，融合进入 EmrE-ApoAI*嵌合体的氮末端，结果显示：这个融合体会分散在细胞质中，并会因为ApoAI*的存在而提高溶解性，实验结果证明这个嵌合体是以二聚体或者四聚体的形式存在，所得到的融合体产率也很高。利用SIMPLEx 技术，我们获得了大量的增溶性蛋白，为研究结构和功能提供了巨大的方便。
2.3 脂质蛋白ApoAI
两亲性蛋白质同时具有亲水性和疏水性，可以和脂质相互作用，在细胞间信息传递和物质交换方面具有重要的作用。比如，脂蛋白的重要组分是ApoAI，它可绑定磷脂分子并组合成为可溶的双层结构或者盘状结构，更加容易接受胆固醇。ApoAI含有两个区域，一个是球状胺基末端区域，另一个是可与脂质结合的碳末端区域。研究表明ApoAI具有明显的结构灵活性11，将球状的无脂质的ApoAI放在生理条件下，通过与脂质的相互作用，它可以适应脂质的立体结构改变。为了验证它的灵活性，截断人类基因ApoAI的球状胺基末端，剩余部分命名为ApoAI*，它可以形成纳米盘进入去污剂溶解的IMPs区域12。在这观察的基础上，我们假设ApoAI*可以提供一个将IMPs的脂质表面和水分离的分子盾，进而提高IMPs融合物的可溶性表达。为了证实这个假设，利用SIMPLEx技术，我们将ApoAI*与目的蛋白IMPs进行融合，并将构建好的质粒在大肠杆菌细胞质中表达，最终获得大量球状的、水溶的、稳定的融合蛋白。SIMPLEx技术为我们提供一种制备IMPs的方法，利用SIMPLEx技术，我们可以在生理水平研究细菌或者人类IMPs蛋白。
2.4 高溶解性的蛋白质OspA
为提高目的蛋白IMPs的可溶性，我们还引进了一种高溶解性的蛋白质OspA13。在实验中将OspA融合进入 EmrE-ApoAI*嵌合体的氮末端。为了验证这个融合体的性能，我们进行一系列的实验。利用SIMPLEx技术，我们在大肠杆菌细胞中获得转换的OspA-EmrE-ApoAI*的细胞，并测定了该细胞的累积量。免疫印迹分析细胞中的可溶性细胞质组分，证实该嵌合体是稳定的，几乎没有水溶性蛋白进入不溶区域；在没有去污剂的情况下，经过细胞裂解和Ni2 亲和层析后，我们在每升培养液中获得了10–15毫克的OspA-EmrEApoAI*融合物；通过尺寸排阻色谱法证实，大多数的可溶性免疫 OspA-EmrE-ApoAI* 是二聚体和四聚体，与先前的结论一致。EmrE 的基本功能单位是二聚体，但也可能包括一个二聚体的聚合体14（四聚体），将二聚体和四聚体分离后，再次利用SEC，结果显示这两个物质的最终产率分别是每8mg/L和10mg/L。值得的注意的是：OspA-EmrE-ApoAI*的溶解度曲线与控制融合几乎相同，OspA-ApoAI*融合部分积累在可溶部分。与之形成鲜明对比的是：EmrE单独表达的蛋白只积累去污剂可溶区域和不溶性区域。OspA-EmrE融合体堆积在三个区域中（水溶性部区域、污剂可溶区域和不溶性区域），EmrE-ApoAI*融合蛋白积累在去污剂可溶区域和不溶性区域，与EmrE单独表达的方式类似。
2.5 SIMPLEx技术的延伸与扩展
为了验证SIMPLEx技术是否可以进一步扩展，先前报道的研究测试了一个结构与EmrE无关的蛋白质，它叫做人类细胞色素b5（cytb5），结果表明该融合蛋白也是可溶的。cytb5是具有一个134残基的膜蛋白，由六个alpha;螺旋和五beta;-桶型折叠成三个不同的领域：（i）含有可溶性域的N-末端的血红素；（ii）C-末端的膜锚定；（iii）由一个连接器或铰链区连接的两个区域。将融合蛋白OspA-cytb5-ApoAI*和OspA-EmrE-ApoAI*进行对比得到：OspA-cytb5-ApoAI*溶解度试验结果与OspA-EmrE-ApoAI*的模式相同，像EmrE一样，当OSPA诱饵被DspMBP 取代时，细胞色素b5溶解度不变，DspMBP 和ApoAI* 的加入不会影响均聚低聚物的形成，溶解的DspMBP-cytb5-ApoAI*主要为八聚体15，DspMBP-cytb5-ApoAI* 明显的红色特征表明增溶没有破坏血红素的表达；通过典型的氧化和还原法纯化DspMBP-cytb5-ApoAI*，纯化后的融合蛋白在424和409nm处聚集，产量为5-8mg/L。另外，还测试溶解的细胞色素b5的功能，原生细胞色素cytb5刺激细胞色素P450c17 17,20 -裂解酶的活性，结果为一摩尔当量的Cytb5将裂解酶反应率提升10倍。在体外检测 DspMBP-cyt b5-ApoAI* 刺激CYP17A1 酶的活性，并与去污剂溶解的野生型细胞色素b5相比较，得出结论：DspMBP-cyt b5-ApoAI* 以剂量依赖的方式刺激酶的活性。在相同的浓度和条件下，去污剂溶解的细胞色素b5刺激活性的的测定是稳定的；在较低的浓度，去污剂溶解的细胞色素b5也呈剂量依赖性16的刺激，这和原有的发现是一致的。因此，去污剂溶解的细胞色素b5比在体内溶解的细胞色素b5能更好的刺激酶的活性。鉴于cytb5的C-末端跨膜螺旋可以激发人类CYP17A1 17,20 -裂解酶的活性，最终得出的结论是：ApoAI *的屏蔽作用必须足够灵活，要保证蛋白质与蛋白质的相互作用，这种作用对促进某些功能是必要的。
