PEG－干扰素－lambda的制备研究文献综述

 2022-12-03 15:43:53
  1. 立题依据

干扰素（IFN）是多功能细胞因子家族中的一员。1957年，Isaacs 和Ljndenmann 利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时发现受病毒感染的细胞能产生一种因子，这种因子作用于其它细胞时能干扰感染病毒的复制，因而将其命名为IFN。目前已知IFN 是一类高活性的多功能糖蛋白，具有抵抗病毒感染、抑制肿瘤细胞生长及调节机体免疫功能的作用。根据氨基酸序列和特异性识别受体的不同，IFN分为I型、II型和新发现的III型。I型包括IFN-alpha;、IFN-beta;，IFN-ε, IFN-kappa;, IFN-delta;, IFN-zeta;等;其中IFN-alpha;包括13种亚型；IFN-beta;只有1种亚型；II型仅有1种类型，即IFN-gamma;； III 型即IFN-lambda;s，是2003年由美国科学家Kotenko和Sheppard两个研究小组共同发现的一类新型干扰素，包括IFN-lambda;1、IFN-lambda;2和IFN-lambda;3 (亦称IL-29、IL-28A和IL-28B)。与I型IFN相似，IFN-lambda;s的生物学效应包括抗病毒，免疫调节和抑制肿瘤增殖等。值得注意的是，与I型IFN受体不同，IFN-lambda;R1的表达具有组织特异性，其在骨髓造血细胞及脑脊髓等中枢神经系统表达量很低。相对于IFN-alpha;在肿瘤治疗过程中的显示出的毒副作用，如易导致受药者疲劳、发热、恶心、抑郁等中枢神经系统症状和造血功能障碍等，IFN-lambda;s由于其受体分布的组织特异性，而有明显差异，从治疗HCV的一期临床试验结果看也是如此，因此可以预期IFN-lambda;s可以在某些肿瘤的治疗上，在发挥相同疗效的同时，能有效地降低毒副作用，有望在不远的将来正式应用于临床，为某些肿瘤的治疗带来新的曙光。

　编码人IFNlambda;s的基因均位于19号染色体（１９ｑ１３．１３）。IFNlambda;1基因有５个外显子，IFNlambda;2和IFNlambda;3基因含６个外显子，这与IL10家族基因相似，而Ｉ型IFN的基因仅有１个外显子。IFNlambda;1由含22个氨基酸的信号肽和包括178个氨基酸的成熟肽组成；IFNlambda;2和IFNlambda;3则均由含22个氨基酸的信号肽和174个氨基酸的成熟肽组成。IFNlambda;2和IFNlambda;3的相对分子质量约为22kDa，有３个二硫键，无糖基化；IFNlambda;1的相对分子量约为20~33kDa，有２个二硫键并在Asn43存在一个Ｎ连接糖基化位点；二硫键对IFNlambda;s的正确折叠和生物学活性十分重要.

　所有Ｉ型IFN结合同样的异二聚体受体IFNalpha;/beta;R，而IFNgamma;蛋白结合IFNgamma;R。IFNalpha;/beta;R、IFNgamma;R和IL10家族的受体都属于Ⅱ类细胞因子受体家族，它们的细胞外结构域均含有包括几个半胱氨酸在内的保守氨基酸残基。实验证明，与其他的IFN相同，IFNlambda;s必须与受体结合后才能发挥作用。IFNlambda;s的受体也是一种异二聚体型Ⅱ类细胞因子受体，由IL10受体beta;亚基（IL10Ｒbeta;也称IL10R2、CRF2-4）和一种Ⅱ类受体（即IL28Ｒalpha;，也称为IFNlambda;R1、CRF2-12）组成，其中IL10Ｒbeta;也是IL10和IL22受体组成部分，而IL28Ｒalpha;则决定其与IFNlambda;s结合的特异性，并介导细胞内信号传递。人IL28Ｒalpha;基因位于染色体ｌｐ３６．１１，含７个外显子，mRNA长约5kb，编码500个氨基酸，其中18个是信号肽，23个是跨膜区，细胞质区含271个氨基酸，细胞外区含208个氨基酸；而IL10Ｒbeta;位于21号染色体上。除了全长mRNA的表达以外，IL28Ｒalpha;在细胞中还存在两种不同的ｍRNA剪切体：其中一种在胞内区缺失29个氨基酸而失去了介导信号传递能力，另一种则仅有胞外区；这两种剪切体的存在可能为免疫细胞对IFNlambda;s的不同反应作出了解释（可溶性受体蛋白能够中和并抑制IFNlambda;s与其受体的相互作用）。IFNlambda;s的两种受体亚基在人的多种细胞系（如HL-60,K-563,MOLT-4,Raji,HeLaS3,SW480,A549,G-361）和组织（如心、肾、皮肤、小肠、肺、骨骼肌、肝等）中表达，IL28Ｒalpha;ｍＲＮＡ在人胰腺、甲状腺、骨骼肌、心脏、前列腺和睾丸中表达较高，而在大脑、脊髓、骨髓中较少

随着基因工程及化学合成技术的发展,越来越多的蛋白质药物被研制出来并在临床应用中表现出许多独特的疗效。与传统的小分子药物相比,这类药物具有在体内半衰期短，易降解，易失活，在胃肠道内不易被吸收及需要大量服用以维持药效等缺点,使其应用受到限制。1977年,Abu2chowski等发现用PEG修饰过的蛋白质比未修饰的蛋白质更加有效。1991年，用于治疗儿童免疫缺陷症第一个用聚乙二醇修饰的蛋白药物PEG-腺苷脱氨(ADAGEN)获FDA批准上市。目前PEG已用于多种蛋白药物的修饰，例如：PEG修饰的门冬酰酶、干扰素-alpha;-2a和2b等多种PEG修饰蛋白药物均陆续通过FDA批准用于临床。PEG修饰的药物与未修饰的药物相比,具有以下突出的优点:(1)更强的生物活性;(2)脂质体对肿瘤有更强的被动靶向作用;(3)更长的半衰期;(4)较低的最大血药浓度;(5)血药浓度波动较小;(6)较少的酶降解作用;(7)较少的免疫原性及抗原性;(8)较小的毒性;(9)更好的溶解性;(10)用药频率减少;(11)提高病人的依从性,提高生活质量,降低治疗费用。

目前,PEG修饰普遍采用的是单甲氧基聚乙二醇(mPEG):CH3O-(CH2-CH2O)n-H。PEG末端的羟基是其化学反应的功能基团,但必须在较激烈的条件下才能与其它基团发生反应。为使蛋白质能在温和条件下,以较高的速率与PEG偶联,须先对PEG进行活化。活化的PEG(分子量一般为5000~20000,也有30000或更高)可与蛋白质分子侧链上的各种化学基团反应而与蛋白质相偶联,蛋白质分子上与PEG进行偶联的基团主要是氨基、巯基和羧基。蛋白质分子中游离氨基较多,其修饰多为随机修饰,修饰后易造成蛋白质活性的损失和最终产品的不均一。巯基则不同,它们在蛋白质组成中通常含量不高,位置确定,因而可针对那些对活性影响不大、呈游离状态的巯基,进行定量、定点修饰。我们选用TCEP做还原剂是因为相比通常使用的DTT而言，DTT首先作为硫醇类还原剂会和硫醇反应标签如马来亚酰胺，碘乙酰胺竞争。所以它通常在蛋白标记之前去除。其次DTT中的硫氨基会减少EPR谱中的硝基氧自旋标签，这样，就消除检测探针的定位和迁移率所需的自由基。最后DTT被无处不在的金属离子氧化，比如铁和镍离子，于是DTT不能在还原态下保存长时间的稳定。因此，我们计划用TCEP将干扰素lambda;1分子间的二硫键还原，保留游离半胱氨酸利于巯基的修饰并通过还原/非还原电泳检测分子间形成二硫键的情况。

二、研究目标

通过摇瓶培养毕赤酵母菌株并诱导表达重组蛋白，用还原/非还原SDS-PAGE鉴定rhIFN-lambda;1内二硫键的情况，采用AKTA系统进行阳离子交换和凝胶过滤层析纯化。用TCEP作为二硫键的还原剂，用PEG-马来亚酰胺作为修饰剂对重组干扰素进行修饰。最后比较不同条件下的修饰效率，摸索出比较合适的修饰条件，为以后生产上市长效而有较高活性的新型干扰素lambda;1奠定基础。

三、研究内容与方法

本课题研究的内容主要包括以下方面：

一、摇瓶培养毕赤酵母菌株并诱导表达重组蛋白

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