双碳基还原酶催化产生他汀类药物手性侧链过程中中间产物的分离纯化及其与酶复合物结构的解析文献综述

 2022-12-29 14:34:02
  1. 研究背景

他汀类药物即羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-COA）还原酶抑制剂是一类高效的降脂药物，不但能调节血脂抑制胆固醇合成，还具有非调血脂作用,广泛应用于高血脂症的治疗。目前，临床上常用他汀类药物 主要有洛代他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托 伐他汀，瑞舒伐他汀和匹伐他汀等[[1]]。大多数他汀类药物都包含有一条双羟基的侧链。研究发现重组双羰基还原酶（rDKR）可以还原相应底物制备他汀类药物的双羰基手性侧链，已经在大肠杆菌中异源表达进行了初步验证。该酶能够将6-苄氧基-3，5-二氧己酸乙酯立体选择性地还原为乙基（3R，5S）-6-苄氧基-3，5-二羟基己酸乙酯并产生短暂中间体乙基（R）-6 -苄氧基-3-羟基-5-氧代己酸和乙基（S）-6-苄基5-羟基-1-羟基-3-氧己酸[[2]]。

在水-有机双相介质中进行酶促合成已成为生产各种化学品的有效方法。氧化还原酶是一种公认的重要生物催化剂，可用于立体选择性地合成各种手性化学品。但由于其对有机溶剂的不稳定性、可能的立体选择性变化和对辅因子的要求，即使在实验室规模下，氧化还原酶在有机溶剂的存在下通常也不太有用。现在重组DKR（rDKR）可用于合成他汀类药物的手性侧链，并初步建立了含有重组DKR（rDKR）的全细胞的酶促过程。但水性介质中的底物浓度低（5 g / l）严重限制了其工业实用性[[3]]。通过对还原过程中中间产物的分离纯化及其与酶复合物结构的解析研究rDKR对有机溶剂的耐受性，保持其催化性能提高其催化效率。完善通过生物催化合成他汀类药物的方法。

  1. 研究意义

双羰基还原酶可以选择性还原beta;，delta; -二羰基酯底物生成相应的双羟基产物 。酶促反应中短暂中间体的出现可以说明反应是按顺序进行的。由于该中间体并不稳定、生命周期短，所以不容易大量累积。研究反应中间体的步骤可以确定哪一步是限定速度步骤，对于5-扁桃酸酯脱氢酶（一种富含电子的碳负离子）在正向和逆向反应过程中均被观测到，根据动力学分析和活化能的计算确定限速步骤[[4]][[5]]。因此，寻找可能的中间体对探明双羰基还原酶促反应的催化机制、反应过程及其反应特征至关重要。

  1. 课题研究内容
  2. 中间产物的分离纯化、DKR的表达及纯化
  3. DKR复合物结晶初筛、结晶条件优化
  4. 晶体衍射及衍射数据分析
  5. 课题工作进度

2020.3-2020.4：前期文献调研，翻译文献。

2020.4-2020.5：中间产物的分离纯化（反应液体系构建、HPLC实时分析鉴定、色谱分离体系构建）DKR的表达及纯化—DKR复合物结晶初筛—结晶条件优化—晶体衍射—衍射数据分析。

2020.5-2020.6：整理实验记录，撰写毕业设计，准备毕业答辩。

参考文献：

  1. 彭昕.他汀类药物临床不同应用[J].临床医药文献电子杂志,2016(37):199-200.
  2. 吴旭日,陈晨,刘楠,陈依军.双羰基还原酶催化的两步羰基还原反应(英文)[J].中国药科大学学报,2010(05):30-35.
  3. Preparation of ethyl 3R,5S-6-(benzyloxy)-3,5-dihydroxy-hexanoate by recombinant diketoreductase in a biphasic system[J].Bioresource Technology,2011,102(3):3649-3652.
  4. Huang Yan,Lu Zhuo,Ma Min,Liu Nan,Chen Yijun. Functional roles of Tryptophan residues in diketoreductase from Acinetobacter baylyi.[J]. BMB reports,2012,45(8).
  5. Huang Yan,Lu Zhuo,Liu Nan,Chen Yijun. Identification of important residues in diketoreductase from Acinetobacter baylyi by molecular modeling and site-directed mutagenesis.[J]. Biochimie,2012,94(2).

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