- 按所设定的色谱条件进样，记录色谱图，考察理论塔板数、分离度、灵敏度、拖尾因子和重复性5个参数。
- 溶液稳定性：将用于含量测定的供试品溶液，放置24h，于不同时间取样测定，计算相对标准偏差（RSD）。
- 专属性：在杂质或对照品可获得的情况下，试样中加入杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，不能获得的情况下，需要与另一确证的方法进行结果比较。
- 精密度:a.重复性:对同一批样品，取6份样品进行测定，计算测定结果的平均值与真实值之差及RSD。b.中间精密度:可于不同日期，用不同仪器，由不同人员对同一批样品进行含量测定，计算RSD。
- 准确度:用已知量的A2003片混合磷酸西格列汀对照品溶液，配制成规定范围内3种不同浓度（高、中、低浓度对照品加入量与A2003片中磷酸西格列汀成分量之比控制在1.2:1,1:1,0.8:1左右）的溶液，每种浓度3份，分析共9份溶液的测定结果，求出加样回收率及RSD。回收率限度要求可参考中国药典。
- 线性及范围:在磷酸西格列汀进样浓度的一定范围内，制备至少5份不同浓度的磷酸西格列汀对照品溶液，测定峰面积与被测物浓度呈比例关系的程度，以最小二乘法进行线性回归，确定该分析方法达到一定精密度、准确度和线性要求时的高低限浓度区间。回归系数（R）应不小于0.998，RSD不大于2.0%。对于制剂含量测定，一般要求线性范围为测定浓度的80%-120%。
- 耐用性:考察不同波长、不同流速、不同流动相比例等微小变化下，西格列汀含量测定结果的变化情况，以保证方法可靠。
三、研究手段
本课题主要依据A2003片即其组成成分的性质，结合文献和药典内容展开试验一、课题研究的背景与研究现状
1.研究背景
糖尿病是一组以血糖水平慢性升高为主要特征的代谢性疾病，主要分为1型糖尿病和2型糖尿病两种。随着人们生活水平的提高，糖尿病早已变成一种常见病，成为全球最为严重的公共卫生问题之一。我国是人口大国，糖尿病患者众多，并以2型糖尿病为主，用药需求巨大。2型糖尿病是由胰岛素作用相对缺乏引起，一般不能治愈，但若不积极控制，容易引发多种并发症，危害机体健康。药物治疗是2型糖尿病患者的主要治疗手段，常用药物有双胍类、alpha;-糖苷酶抑制剂、胰岛素促泌剂、二肽基肽酶V (DPP-4)抑制剂、胰高糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂、钠-葡萄糖共转运蛋白2 (SGLT2)抑制剂等[1]。
A2003片，是一种由默沙东公司研制的西格列汀和二甲双胍的复方制剂，每片含50mg磷酸西格列汀（以西格列汀计）和850mg盐酸二甲双胍，一般用于经二甲双胍片治疗后血糖仍控制不佳的2型糖尿病患者。二甲双胍是2型糖尿病的首选药，但在临床应用中易发生低血糖和胃肠道不良反应[2]。西格列汀作为一种DPP-4抑制剂，通过增加活性肠促胰岛激素的水平，以葡萄糖依赖的方式促进胰岛素释放并抑制胰高糖素分泌来控制血糖，不易发生低血糖反应，具有安全性好、可口服、不良反应少的优点[3]。它们均可单独用药，也常与其他降糖药物联合使用。无论其单方还是复方都在全球降糖药市场中占领重要位置，在各大药企中备受瞩目。另有研究显示，对2型糖尿病患者使用A2003片治疗，其有效率明显高于使用二甲双胍片治疗，能强效持久地降低患者血糖，改善二甲双胍片不能长期控制血糖的问题[4]。我国A2003片用量大，但目前尚未收载其质量标准。西格列汀的含量是衡量A2003片质量的重要指标，开发其含量测定方法对建立A2003片的质量标准具有重要意义，有助于保障药品质量，保护患者用药安全。
2.研究现状
(1).西格列汀含量测定研究现状
美国药典[5]和欧洲药典[6]中有水合西格列汀原料及西格列汀片剂的相关标准，其色谱条件几乎相同，均采用高效液相色谱法测定西格列汀的含量。色谱条件：色谱柱规格：5mu;m 150times;4.6mm；流动相：A项为乙腈，B项为1.36g/L磷酸二氢钾（磷酸调节pH至2.0），A：B=15:85（v/v）；流速：1.0mL/min；进样量：20mu;L；柱温：30°C；检测波长：205nm。
文献中也有报道西格列汀原料药和西格列汀片的含量测定方法。王兵[7]等采用C18（250mmtimes;4.6mm，5mu;m）色谱柱，以0.01mol/L磷酸氢二钾溶液(用磷酸调节pH至6.5)∶乙腈=8∶2为流动相A，乙腈为流动相B，A：B=70∶30（v/v）等度洗脱，测定西格列汀原料药的含量。该方法主要通过调整流动相配比和柱温，来改善色谱出峰时间和峰形。测定结果显示该方法准确、简便，在0.2300~0.3942mg/mL浓度范围内线性良好，R=0.9995，适合于西格列汀含量测定。陈涛[8]等选用Agilent 1200 HPLC 色谱仪，色谱柱为辛基硅烷键合硅胶柱—雅源C8 CDYY（150times;4.6mm，5mu;m），其余色谱条件与美国药典大致相同，建立了西格列汀片含量测定方法。通过对四批样品的进行测定，发现结果准确可靠、重复性好，适用于磷酸西格列汀片的含量测定。李勤勤[9]等通过筛选色谱柱、流动相组成、流速、柱温、进样量和检测波长等色谱条件，确定选用安捷伦1220高效液相色谱仪，色谱柱为Agilent ZORBAX SB-CN （150times;4.6mm，5mu;m），以210nm为检测波长，测定西格列汀含量。在实际的西格列汀含量测定中应用性质良好。张金芬[10]等选用TIANHEreg;Kromasil C18色谱柱（200times;4.6mm，5mu;m）；流动相为甲醇：0.1% HClO4=45:55（v/v）；流速为0.8mL/min；柱温为25°C，进行自制西格列汀片含量测定。通过改变流动相的酸性，避免流动相过酸对色谱柱造成伤害；通过不断调整流动相的比例和流速，得到合适的主峰保留时间。该方法在6.4-96mu;g/mL的浓度范围内线性良好，简便快捷，结果可靠。
文献中西格列汀含量测定方法大致相同，最常用的色谱条件是使用C18色谱柱，以乙腈-磷酸盐溶液体系或甲醇-高氯酸水溶液体系为流动相，以西格列汀最大吸收波长205nm为检测波长，柱温在30°C左右。A2003片作为一种复方制剂，含有另一主药成分盐酸二甲双胍，其分子中同样含有共轭结构，且在200nm-260nm处均存在紫外吸收。因此，直接使用文献中的色谱条件，可能会出现干扰现象。汤瑶[11]等在测定磷酸西格列汀含量时，以268nm为检测波长，采用Symmetry C18柱（150mmtimes;4.6mm，5mu;m），甲醇：0.1%HClO4=32：68（v/v）为流动相。结果显示该方法简便、灵敏，适合于磷酸西格列汀的含量测定。考虑到二甲双胍在268nm处无紫外吸收，可选择此波长作为检测波长进行试验。但由于268nm并不是磷酸西格列汀最大吸收波长，有可能出现灵敏度不够的问题。
