基于Gateway系统的植物基因克隆技术浅析
摘要：植物基因的克隆技术在生命科学研究中占据着极为重要的地位，也是现代生命科学技术中最核心的内容。而随之科学技术的飞速发展，也出现了各式各样的基因克隆方法。而本文主要介绍的是Gateway技术的基本原理以及三种常用的构建入门载体的方法。
关键词：基因克隆；Gateway技术：入门载体：TA克隆
一、文献综述
（一）植物基因克隆技术的发展历程
植物基因的克隆技术在生命科学研究中占据着极为重要的地位，也是现代生命科学技术中最核心的内容，随着20 世纪 70 年代初 DNA 体外重组技术的发明，植物基因克隆技术也逐渐发展起来。它将目的基因与具有自主复制能力的载体DNA在体外进行重组，并将新的重组DNA导入到受体细胞中开展后续的研究。
基因克隆技术从诞生到现在经历的过程可大致分为三个阶段。第一个阶段是20 世纪 70 年代初经典的基因克隆技术的创建[1-2]。经典的基因克隆技术就是依赖限制性内切酶和连接酶的一种克隆方法，其中最为人所熟知和常为人所用的就是平末端克隆法和粘性末端克隆法。两者的原理是利用限制性内切酶能够识别并切割特异DNA序列的特性，从而得到具有平末端或是粘性末端的目的DNA片段和备用载体。然后通过DNA连接酶的连接作用，将具有平末端或是粘性末端的目的DNA片段和载体连接形成重组DNA。不久之后又出现了不依赖限制性内切酶，只需要连接酶的克隆技术——TA克隆和异质交错克隆技术。其中TA克隆的原理是由Taq DNA聚合酶扩增而来的PCR产物中大多数具有一个带A尾的3，末端，而这些特殊的PCR产物会与3，末端带有一个T突出的载体即T载体根据碱基互补配对原则发生互补连接，继而得到重组DNA。而异质交错克隆技术是利用两对PCR引物对同一目的片段进行两次PCR扩增。其中第一次PCR的上游引物5，端引入GGG，第二次PCR的下游引物也引入GGG，将两次PCR所得的4个DNA片段与3，端GGG突出的载体连接，就可得到含目的片段的重组质粒[3] 。第二个阶段是 20 世纪 90 年代初不依赖连接酶的克隆方法的出现[4]。这种方法主要是依赖于DNA修饰酶，这些DNA修饰酶可以使得目的基因和载体分别形成一定长度且互补的3，或5，突出末端，当这些突出末端在退火复性时会因为互补而达到DNA重组的目的。第三个阶段是由Invitrogen公司推出的Gateway技术该技术将重组酶引入到体外基因克隆中，产生了位点特异性DNA重组技术[5]。重组酶不仅具有识别载体和外源DNA 上的重组酶特异识别位点的功能，还具有催化在相应位点发生断裂和重接，从而实现DNA重组的功能。Gateway 重组克隆技术不只是规避了基于限制性内切酶的传统克隆技术的各种限制因素，更为关键的是它只需通过简单的几步即可进入几乎所有表达系统中。 从蛋白质表达到功能分析，Gateway 克隆技术适用于各类研究领域以及多学科研究。
本文将简单地介绍Gateway 克隆技术的原理，并且选择了比较具有代表性的三种制备入门载体的方法（pENTR-1A、pENTR-D-TOPO、TA克隆法），分别进行基因克隆实验，通过实验的过程以及结果来分析这三种入门载体制备方法的特点以及各自的优缺点。希望通过本次研究，使得人们对现今较为通用的几种克隆技术的原理、过程、优缺点有初步的了解，便于人们在进行自己的实验时可以快速地、正确地选择一种最佳的目的基因的克隆技术。
