文献综述
白栎SSR--PCR反应体系优化与引物筛选
1.白栎简介
白栎（Quercus fabri），属壳斗科（Fagaceae）栎属（Quercus）植物。主要分布于我国淮河以南、长江流域、华南、西南各省区，一般生长于海拔1900m以下丘陵山区及山坡杂林木中（郑万钧，1985）。果实富含淀粉，是我国传统食品的原料之一，可酿酒、制腐干、粉丝等。其具有耐干旱瘠薄、萌芽能力强的特性，也被广泛应用于水土保持、薪炭柴等方面（刘仁林等，2009；尹月斌等，2013）。
2.SSR-PCR反应体系的优化
2.1 原理
微卫星又称简单重复序列(Simple sequence repeats, SSR),是以1-6个核苷酸为单位组成的串联重复序列。SSR是基于聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)的一种分子标记技术，具有多态性高、重复性好、操作简便、共显性等优点（Provan et al., 2001），微卫星序列与基因组中其它序列相比，变异频率很高，所以是在不同基因组间进行遗传信息通讯的最为有效的遗传工具之一，广泛应用于动植物遗传多样性的研究中（Cardle et al., 2000；罗冉等, 2010；糜亚男等，2015）。利用PCR反应不需要进行克隆，开始只需要少量目标序列分子就能获得大量的特异DNA序列，无需大量提取DNA。该反应主要包括三个基本步骤：1.双链DNA模板的变性：模板DNA加热一段时间后，双链DNA解离称为单链，以便与引物结合，为之后的反应作准备；2.一对引物与待扩增区域发生退火：引物与DNA单链进行互补序列配对结合；3.引物的延伸：使用耐热的DNA聚合酶（Taq聚合酶）进行扩增。这三个完整的步骤称为一个循环，在第一个循环结束后，由原始模板合成两个新的双链分子。这些分子在后面的循环中都作为模板，因此分子扩增以几何级数增加。SSR-PCR反应体系含较多组分，均可能对反应的敏感性、特异性和结果产生影响，如镁离子浓度、引物、脱氧核苷酸（dNTPs）、Taq聚合酶等，且不同物种间适宜的SSR反应条件也不尽相同（周海兰等，2016）。
2.2 方法
首先，采用改良的 CTAB 法（Doyle，1987）和植物基因组试剂盒提取DNA。其次，进行引物的初步筛选，PCR反应的体系主要包括扩增缓冲液、dNTPs混合物、一对引物、Taq聚合酶、Mg2 及双蒸水（ddH2O）,需要设计的反应条件有变性-退火-延伸三个过程的温度点、反应的时间及循环次数。在扩增完成后，使用电泳的方法检测引物的扩增效果，根据条带的带型、清晰程度等进行引物的初选。接着使用具较高分辨率的聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）技术检测初筛选引物的多态性，并选取一定样品利用上述引物及体系进行PCR的扩增。继而使用毛细管电泳法对SSR分子标记进行检测。数据处理方面，包括SSR数据的判读、对每个位点哈迪-温伯格平衡和成对位点间的连锁不平衡的检测，以及后续对每个群体遗传多样性的分析。从而建立SSR-PCR反应的优化体系，筛选出适合于体系的引物。
