共价固定化酶的连接方式研究进展
摘要：在酶的固定化方法中，化学连接方法有着非常多的优点，比如连接更加稳定、可重用性良好等。传统的化学方法通常有着反应简单、成本低等特点，但是因为它们的随机连接方式，大多数会对酶的活性有一定的影响，而且具有一定的毒性，比如说戊二醛等。还有一些常用的方法反应时间非常的长，比如环氧基等。本文列举了十种化学固定化连接方法，并对这些方法进行简单的介绍。
关键词： 酶 固定化 化学连接 交联剂
文献综述
酶的固定化
酶是一种极其重要的生物催化剂，它广泛地存在于植物动物微生物的活细胞中 [1]。它具有高度特异性，催化性能以及可降解性，因此它被用于许多的领域，比如生物，化学，制药，农业以及食品等等，而且它所应用的领域还在不断增加 [2]。然而，因为酶稳定性低，难以回收，缺乏可重用性导致它无法在工业中运用（综述类固定化酶金属）。固定化是解决这些问题的一个非常有用的方法，通过酶的固定化可以提高酶的稳定性，而且能让酶易于回收 [3, 4]。固定化也会改善对反应的控制，减少酶对产品的污染 [5]。
酶的固定化方法有很多，大致上包括吸附法，包封法，交联法以及化学连接法 [4, 6, 7]。但是，物理吸附法中酶和载体之间的相互作用较弱而且可逆，容易受pH和温度的影响，比较不稳定，而包封法的高扩散阻挡层阻止了大分子通过网络的基板 [1]。而与吸附相比，化学法的一个明显的优点就是酶即使在苛刻的条件下仍然存在于载体上，化学法结合强度高，延长了固定化酶的使用寿命 。
常用的化学方法通常是通过含有环氧基、咪唑基、琥珀酰亚胺等基团的载体与酶上的胺基反应形成化学键，或者通过交联剂比如戊二醛等将载体和酶连接在一起 [8-10]。
化学连接方法
戊二醛[11-19]是传统方法中最常用的交联剂因为它操作简单而且方法比较成熟。戊二醛偶联法最常用的方法是将酶固定在基于席夫碱反应的氨基功能化载体上。在这个过程中，戊二醛的一个醛基与载体上的胺基反应，另一个醛基与酶上的胺基反应连接在一起 [1]。过量的戊二醛或者持续的反应可能会使维持酶活性所需的构象丧失而导致酶失活 [20, 21]。不仅如此，戊二醛固定化的方向无法控制以及戊二醛的毒性使戊二醛在工业生产中受到限制。
京尼平是从栀子果实提取的栀子苷酶解得到的，是一种优良的天然的蛋白质和壳聚糖的交联剂 [22-24]。虽然戊二醛是固定化蛋白质时最常用的交联剂，但是它的毒性和致癌性也阻止了它在食品领域的发展。据报道京尼平的毒性比戊二醛低5000-10000倍，而且具有较好的活性，是戊二醛的良好替代品，适用于食品应用 [22-24]。
点击化学是由化学家巴里·夏普莱斯在2001年引入的一个合成概念，主旨是通过小单元的拼接，来快速可靠地完成各种化学合成。点击化学是一种多功能的生物正交反应，包括叠氮基和末端炔烃之间的环加成。点击手柄可以被特定地结合到目标分子中，从而得到所需要的化学键 [25]。
