姜黄素诱导HepG2细胞自噬的实验研究
摘要：目的：利用HepG2肝癌细胞，研究姜黄素对细胞毒性、细胞增殖和自噬的诱导作用，探讨细胞自噬在姜黄素抗肿瘤活性中的作用。方法：体外培养肝癌HepG2细胞，用不同浓度6.25、12.5、25、50、100uM姜黄素处理24h；MTT法检测细胞增殖；Western blot检测自噬相关蛋白Beclin1 和LC3 的表达；PCR检测HepG2细胞中两种溶酶体相关基因、三种自噬相关基因和TFEB转录因子的表达。结果：姜黄素明显抑制HepG2细胞的生长，呈时间-剂量依赖性。随着姜黄素浓度的增加，存活率逐渐降低，姜黄素对HepG2细胞作用24h的IC50为25uM左右。Western blot结果显示随着姜黄素剂量的不断增加，自噬相关蛋白Beclin1，LC3-II蛋白的表达量明显增加；PCR检测了两种溶酶体相关基因、三种自噬相关基因和TFEB转录因子的表达，除WIPI1以外，其它基因表达水平都有统计学差异。结论：1.姜黄素抑制HepG2细胞增殖效应呈剂量依赖性；2.，姜黄素抑制HepG2细胞增殖的效应可能和诱导自噬有关；3.姜黄素诱导自噬可能是通过对TFEB的调控来发挥作用
关键词：姜黄素；肝癌细胞；细胞自噬
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原发性肝癌的主要类型，是最常见的恶性肿瘤之一，在全球消化系统肿瘤病死率中占第三位，其发病率呈上升趋势，尤其是发展中国家，而我国是全球肝癌发病率最高的国家。其在男女性中分别为肿瘤所致死亡的第二和第六大死因，相关报道每年约600000 名死亡病例。且某些肝癌的发病机制尚不明确。因此，肝癌对人类生命健康的危害不容忽视。据最新的数据显示，肝癌已成为威胁人们健康的重要因素。防治原发性肝癌、降低肝癌病死率已经成为亟待解决的难题，分析原发性肝癌的危险因素、探究原发性肝癌的保护因素是预防肝癌发生的重要方向。研究者们一直在寻找安全有效地治疗肿瘤的方法，肿瘤药物治疗从1941年发现的氮芥、1971年确立化疗在肿瘤治疗中的地位到现在热门的靶向治疗，而这些药物均通过了食品和药物管理局（Food and Drug Administration）FDA 的认证批准，但FDA批准的这些药物有70%来自天然产物植物，且这些植物通常被用于治疗各种各样的疾病。长春花中提取得到的长春花碱就是其中最早的例子；而紫杉类植物中提炼出的紫杉醇已广泛应用于临床。随着近几年的研究发现，姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡是其重要的抗癌作用方式。
姜黄素(Curcumin)是一种植物多酚，来源于姜黄、郁金、我术、石菖蒲等的根茎，可应用于食品添加剂、膳食补充剂，属于天然酚类抗氧化剂，化学结构为C2lH20O6，主链为不饱和脂肪族及芳香族基团，分子量368.37，熔点183℃，其水溶性较差，易溶于醋、碱、DMSO、氯仿等多种有机溶剂，且光稳定性差，见光易分解。目前姜黄素以胶囊、片剂、药膏、肥皂、化妆品等多种形式在全世界国家畅销，主要产区在亚热带如中国、印度和日本等地。传统上，这类物质在亚洲国家曾用于人类多种疾病如粉刺、皮炎、皮疹；作用于许多动物及人体的大量试验和临床研究证实这种化合物具有多种药理学功效，如抗氧化、抗感染、抗炎、降血脂和抗动脉粥样硬化等作用。近年来，姜黄素的抗肿瘤作用吸引了众多研究者关注，动物研究发现给予姜黄素处理可以抑制致化学癌物诱导的乳腺癌和肝癌，以及APC突变导致的结肠癌的发生，以及有报道说。姜黄素对肺癌、乳腺癌、肝癌、结直肠癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤、白血病等多种恶性肿瘤均具有抑制作用，并且具有良好的生物安全性，因此美国癌症研究所已将其列为第三代癌化学预防药。
研究发现，姜黄素的抗肿瘤活性与多种作用机制有关，比如，姜黄素能选择性杀伤肿瘤细胞，与其调控肿瘤细胞周期、增殖、自噬、凋亡、侵袭转移、血管生成，以及逆转肿瘤耐药、增强NK细胞活性等都密切相关。此外，姜黄素这种物质参与细胞多条信号通路，如AKt，MAPK，p53，JAK/STAT等，姜黄素通过调节这些信号靶分子激活细胞死亡途径或诱导肿瘤细胞凋亡来一直肿瘤细胞的存活；姜黄素可同时诱导子宫肉瘤细胞SKN和SK-UT-1细胞凋亡和自噬，从而抑制细胞增殖；在A549肺癌细胞，姜黄素通过激活AMPK蛋白激酶而诱导细胞自噬，从而抑制细胞生长。有研究发现，姜黄素衍生物B19和EF25-(GSH)2可分别诱导卵巢癌细胞HO8910和肝癌细胞HepG2细胞凋亡和自噬，细胞自噬抑制剂Chloroquine在抑制姜黄素诱导的自噬的同时，可以增加凋亡，提示自噬对姜黄素衍生物诱导的细胞毒性是一种保护作用。然而目前姜黄素诱导的细胞自噬对于其抗肿瘤活性的影响还不清楚，近年来研究表明自噬在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用，诱导或抑制自噬都可能成为有效的肿瘤治疗措施。
自噬，又称为细胞的自体溶解，是细胞生长、分化、存活和自我平衡的重要途径，是细胞内的物质成分利用溶酶体被降解过程的统称。自噬的分子机制、自噬的信号转导及调节是一个很复杂的过程。自噬的发生过程可分为四个阶段：第一是自噬启动阶段，在细胞内外压力刺激下，由前自噬体结构（pre-autophagosomal structure，PAS）开始形成双层膜结构的分隔膜；第二是自噬体（autophagosome）形成阶段，分隔膜延伸、弯曲，将要被降解的物质隔离形成自噬体；第三步是自噬-溶酶体(autolysosome)形成阶段，自噬体通过细胞微管网络系统被运输到溶酶体，完成融合过程；第四步是溶酶体内容物的降解阶段，经过囊泡酸化后，在蛋白水解酶的作用下，溶酶体的内容物被降解。在肿瘤发生过程中，自噬有两种功能，一方面，自噬可以降解癌蛋白及其底物和损伤的细胞器，因此抑制癌症的发生；另一方面，通过自噬介导的细胞内物质循环，可以为癌细胞生长提供必须的代谢底物和能量，因此可以促进肿瘤的生长。研究发现，多种抗癌物质通过诱导肿瘤细胞凋亡杀死癌细胞的同时，可以诱导细胞自噬。基于抗癌物质的作用机制和癌细胞种类，自噬可能对抗癌物质的细胞毒性有保护作用，也可能是抗癌物质诱导癌细胞死亡的必要条件。
目前已发现近40种自噬相关基因, 参与自噬调控。它们多以复合体的形式分别在自噬诱导、起始、延长和成熟降解阶段发挥作用。根据细胞内底物运送到溶酶体腔的方式不同，自噬可分为大自噬、小自噬、分子伴侣介导的自噬。此外，还有些选择性自噬如线粒体自噬、聚集体自噬等。不同类型的自噬其发生过程不同，参与的蛋白分子也不同。通过检测不同自噬过程中的分子标志物的水平、状态与定位有助于评价细胞的自噬水平。LC3是目前唯一一个定位于自噬泡的蛋白，是自噬体的标志分子，随着自噬体膜的增多而增加。LC3-Ⅱ的含量或者LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值，与自噬体的数量呈正相关，在某种程度上反映了细胞的自噬活性。Beclin1主要定位于反面高尔基体内质网和线粒体，它们通常以 Beclin1/PI3K3C 复合体发挥作用，在Beclin1依赖的自噬中，PI3K活性在自噬体形成中至关重要，因此Beclin1可用于监测对自噬的调节影响。此外Beclin1可与UVRAG结合调节内质网上Vps34的激酶活性。因为自噬过程最终是在溶酶体中进行的，因此溶酶体标志蛋白在研究自噬时尤为重要，目前含量最高的膜蛋白就是溶酶相关蛋白LAMP。组织蛋白酶A（CTSA）是溶酶体beta;-半乳糖苷酶和神经氨酸酶一起形成的高分子量的多聚复合物，参与多种生理和病理过程发挥重要的作用。WIPI1蛋白是一种新发现的细胞自噬标记分子，WIPI1是最早被证实参与，自噬调控的WIPI1家族成员，通过其beta;折叠内的特异性FRRG基序与PI3P 结合，参与自噬体的形成以及自噬体-溶酶体的融合。通过研究自噬标志物有助于探讨姜黄素抑制HepG2细胞增殖是否与参与细胞自噬有关。此外，溶酶体在自噬过程中起到至关重要的作用，有研究发现姜黄素可诱导转录因子EB（TFEB）的转录活性，促进HCT116细胞内溶酶体酸化及酶活性，但是目前对于在转录水平上的研究报道的并不多。正常情况下，TFEB定位于细胞质中，当其从磷酸化转变为去磷酸化时，便入核参与转录功能。已经公认的TFEB的靶基因不仅包括了自噬相关基因，如LC3、Atg9B、p62等，也包括了许多溶酶体相关基因如LAMP、CTSA等等。
恶性肿瘤是导致人类死亡的重大疾病，有关其发生发展机制及治疗方面的研究都值得更加深入地探讨。自噬是细胞内重要的降解—循环系统，能够清除细胞内受损、衰老的细胞器及错误折叠、变性的蛋白质，并加以再利用，这对于维持正常细胞的能量代谢和内稳态至关重要。业已证实，自噬活性的改变与肿瘤的发生、发展、诊疗等都密切相关。因此，靶向干预自噬调控信号通路如PI3K/Akt/mTOR、AMPK、ERK1/2、p53、PTEN及溶酶体、自噬蛋白复合体等是抗肿瘤治疗的重要策略。肿瘤细胞往往对化疗药物产生多药耐药，且化疗药物毒
