限制性内切酶XhoΙ基因的合成与表达研究文献综述

 2022-12-03 15:46:41

本科生毕业论文开题报告

课题名称： 限制性内切酶XhoIota;基因的合成与表达研究

  1. 课题研究的目的、意义

限制性内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构核酸水解酶。限制性内切酶是当代基因工程研究不可缺少的重要工具，它的纯度直接影响基因克隆、核苷酸序列分析、以及酶学性质研究等实验结果。自上世纪60 年代末期，人们提出第一个限制性内切酶之后，越来越多的限制性内切酶被发现提纯及应用。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。某些限制性内切酶的价格依然居高不下!其主要原因在于表达量低'提纯程序繁琐'得率低等问题的存在，到目前为止，已经分离出可识别230 种不同DNA 序列的Ⅱ型限制性核酸内切酶达2300 种以上。

限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 例如：HindⅢ　　前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。在限制性核酸内切酶作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 碱基甲基化，甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5rsquo;-甲基胞嘧啶和6rsquo;-甲基腺嘌呤，在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。在此修饰酶的保护下，则可免受限制性核酸内切酶的降解。由于限制性核酸内切酶的发现与应用而导致体外重组DNA 技术的发展，使人们有可能对真核染色体的结构、组织、表达及进化等问题进行深入的研究。因此，有人赞叹限制性核酸内切酶是大自然赐给基因工程学家的一件了不起的礼物。

  1. 课题研究内容

本课题中，需通过PCR手段合成XhoI限制性内切酶基因、XhoIota;甲基化酶基因。在合成过程中，因基因片段过长，需将基因进行分段，借助引物等合成基因片段，并通过连转，菌检，测序等手段直至获得正确的基因片段。再在载体中多段重组成完整基因，也需经过连转，菌检，测序等手段获得正确的XhoIota;限制性内切酶基因、XhoIota;甲基化酶基因。为了避免限制酶性内切酶切割自身基因，在构建重组表达载体时，需将XhoIota;甲基化酶基因先于XhoIota;限制性内切酶基因链入载体。通过重组获得重组子，进而通过各种表达条件的优化，获得XhoIota;限制性内切酶，对酶产物进行分离纯化，并对酶的特性，质量进行衡量。

三、研究方法，路线

主要流程：

基因的合成： XhoIota;内切酶基因片段PCR合成 导入PUC57载体中 转化大肠杆菌 菌检 测序 PCR扩增正确片段 导入 PUC19载体（多段重组） 转化T7感受态细胞 菌检 抽质粒 送测序 保留正确的质粒（即得到完整目的基因）

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