题目：灰葡萄孢病菌的分子快速检测
1、 课题研究目的和意义
灰霉病是葡萄生产中危害最大的病害之一,发生普遍,并随着设施栽培面积的扩大而日益严重。葡萄灰霉病不仅是生产田中常见病害,更是产后贮藏过程中的毁灭性病害。虽然有高效杀菌剂和先进的贮藏技术,但每年因灰霉病造成的葡萄产后损失依然高达50%,一般损失在20%-30%左右。
葡萄灰霉病症状田间灰霉病菌主要危害花冠、花序和果实,也能危害幼叶。花序发病初期病部呈淡褐色,随后变暗褐色软腐病萎蔫,严重时整个花序坏死,表面密生灰色霉,稍一触动,即可到处飞扬。葡萄灰霉病在田间通常造成落花落果和果实腐烂。贮藏阶段,浆果染病早期在果皮上出现直径2～3 mm的圆形凹陷病斑,果肉仍维持原有硬度,病斑颜色稍浅于周围的正常组织。用手轻擦病斑部位,可见表皮易与果肉分离而发生局部脱落,如果用手按压病斑则病处表皮破裂果肉暴露。葡萄一旦染病后病程发展十分迅速、难以控制。在适宜发病的环境条件下几天后即发生落粒和果实软腐,果皮上开始聚积并产生大量灰至浅黄色的菌丝和分生孢子的现象,使果实完全失去商品价值。
运用LAMP研究灰葡萄孢的优点有：1.灵敏度高:LAMP一般能检测到比PCR低10倍的拷贝数,能满足低拷贝数样品检测的要求；2.特异性强:由于LAMP通过4条引物与靶序列上的6个特异性部位准确结合来产生扩增。因此,理论上能获得比PCR更高的特异性；速度快:LAMP是恒温扩增反应,没有PCR反应中温模板的退火、复性过程,在30~60 min内即可完成反应过程,能满足临床样本快速检测的需要；设备简单:LAMP反应只需要一个简单的恒温设备,不需要购置昂贵的PCR仪,易于在基层检验检疫部门推广应用。操作简便等
2、 国内外研究现状
2.1.1LAMP技术的原理
LAMP技术是通过两对特殊设计的引物,利用Bst DNA聚合酶的链置换活性提供反应的动力,在恒温条件下完成对目标DNA的大量扩增。反应的关键在于茎环结构的形成,内引物通过结合到茎环结构环状区域的互补序列上,在Bst DNA聚合酶作用下合成延伸并发生链置换。由于没有常规PCR的退火、复性过程,因此反应可在恒温下进行。
2.1.2LAMP技术的反应过程
循环起始物的形成：
