杨树中AtR78同源基因的克隆及CRISPR/Cas9靶位点分析
文献综述
AtR78是编码拟南芥中的一种激酶，属于类受体蛋白激酶家族。有研究显示拟南芥R78的功能缺失突变体抗铝性显著增加，超表达后对铝敏感。CRISPR-Cas系统作为一种新兴的基因定点编辑工具已在多个植物中成功得到应用。本课题首先在杨树中克隆AtR78的同源基因，并对其CRISPR/Cas9基因编辑的靶位点进行分析，来构建CRISPR/Cas9植物基因编辑系统敲除杨树R78基因的表达载体。
- 基因编辑技术
基因组编辑是一种旨在对基因组进行定点修饰 的新技术，主要包括锌指核酸酶（Zinc-Finger Nucleases，ZFNs）、类转录激活样效应物核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALENs）和成簇的规律间隔性短回文序列 Cas9（Cluster Regularly Interspaced Short Palindrome Repeats/CRISPR-Associated（Cas）Protein 9，CRISPR/Cas9）3种核酸酶【4】。利用这 3种有效的基因组编辑工具可以获得遗传修饰动物，在研究基因功能和人类疾病机制上起到很关键的作用[1-6]。在对DNA 靶位点修饰的过程中，ZFNs和TALENs需要多个蛋白的参与，CRISPR/Cas9 系统只需要依靠 1个Cas9 蛋白和 1 个 sgRNA 就可以完成对特定序列的切割【4】。成簇规律间隔短回文序列( clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)是细菌和古细菌在不断进化的过程中获得的一种适应性免疫防御机制，该结构与一些功能相关的蛋白质(CRISPR-associated，Cas) 合称CRISPR-Cas系统【5】。由于其致突变效率高、操作简单及成本较低的特点，近年来对CRISPR-Cas 系统的研究获得越来越广泛的关注。该系统迅速在各领域中得到广泛应用，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。CRISPR/Cas9 技术可对基因组进行定点修饰，近几年已被广泛用于细胞和生物体中，是目前最新、最高效的技术之一【8】。在动物基因组修饰中也有应用，如 sgRNA 的设计、ssODNs 模板的设计以及降低脱靶效应的研究，从而为提高 CRISPR/Cas9 基因组编辑效率奠定基础。在番茄中通过靶向设计分析，通过设计筛选出番茄SLACS2基因的sgRNA，以期利用CRISPR-Cas技术抑制SLACS2基因表达提高番茄的耐贮运性能提供依据【1】。基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑已被成功应用于多种细胞类型中。计算机辅助的向导RNA (Guide RNA) 设计是使用CRISPR系统成功进行基因编辑的关键步骤之一。可以通过建立高效的计算模型，对当前的异质基因编辑数据进行整合挖掘，以获得无偏差的sgRNA设计规则，并预测影响sgRNA设计的关键特征。对于sgRNA打靶和脱靶效果的系统总结和评价，将有助于使用CRISPR系统进行更加精准的基因编辑和基因治疗【7】。并且高效切割位点的RNA，为在位点定点敲入外源基因打下基础。这些都为杨树中AtR78同源基因的克隆及CRISPR/Cas9靶位点分析提供指导，来更深入研究杨树抗铝性机制。
二、植物抗铝研究
铝毒是酸性土壤上限制作物生长最重要的因素，严重影响着全世界和中国大约40 %和21 %耕作土壤的作物生产。近几十年来，世界各国针对植物的铝毒及其耐铝机制进行了大量的研究，并取得了较大进展。在一般情况下，土壤中的铝以对植物没有毒害作用的硅酸盐磷酸盐氧化物和硫化物等形式存在然而随着自然条件的改变或人类活动的加剧，有些土壤的PH值逐渐降低，进而成为酸性土壤。铝对植物的毒害部位主要是根尖，包括根冠和根分生区，因此，植物发生铝毒害的最主要症状是抑制植物根尖细胞的伸长和细胞分裂，使植物根变短、变粗，影响根对水分和养分的吸收，进而限制整个植物的生长。同时，铝离子能与植物体细胞壁的胶质、蛋白质等成分结合，降低细胞壁的弹性和导水性，影响植物的生长【11】。在酸性土壤环境中，不溶性的铝化物就转变为溶解状态的铝（Al3 ）【12】，铝进入土壤对植物产生毒害作用铝首先抑制植物根的正常生长和发育，影响植物根系对水分和养分的吸收，最终影响植物的生长和作物产量在细胞水平上，铝还可能与细胞膜上的膜脂和膜蛋白结合，破坏质膜的完整性【12】。近几年，随着基因组学蛋白质组学及生物信息学的迅猛发展，极大地推动了植物耐铝机制的研究向分子水平的方向深入，差异显示PCR (DDRT-PCR )、抑制差cDNA文库(SSH )、DNA微正列和蛋白质组学等技术的应用【12】 。植物对铝毒的抗性是和ALMT或者MATE基因的表达程度成呈正相关的。在一些物种中，如在小麦和大麦中，TaALMT1和HvAACT1基因的表达是组成型表达，铝离子只是起到激活蛋白转运的作用；在另外一些物种中，铝离子首先是诱导其基因的表达，然后再激活这些新合成的蛋白，如高粱的Sb-MATE基因【11】。AtR78作为编码拟南芥中的一种激酶，显示拟南芥AtR78的功能缺失突变体抗铝性显著增加，超表达后对铝敏感，利用CRISPR/Cas9系统作为基因定点编辑工具，来帮助研究杨树抗铝新种打下基础。STOP1基因编码的Cys2-His2锌指蛋白位于细胞核内，正常表达STOP1蛋白，使拟南芥具有低pH和铝的抗性，但是在stop1拟南芥突变体中，铝诱导的AtALMT1和AtAMTE基因的表达及与之相关的苹果酸和柠檬酸的分泌均受到抑制。在很多抗铝植物中，铝刺激根尖有机酸(如苹果酸、柠檬酸和草酸)的分泌被认为是植物抗铝的一个最重要的机制【11】。铝毒是酸性土壤中植物生长和作物生产的主要限制因子近年来的很多研究应用差异显示抑制差减文库和微正列等技术，在一些铝耐受型和敏感型植物中鉴定了很多铝胁迫响应基因，本研究也就是为杨树抗铝毒胁迫研究以培育更加优良杨树新种，并需要在生产实践中加以验证，在更复杂环境下检验其效果，能切实地按照品种的需要定向培育优良的亲本，真正地实现定向培育、优质培育。
三、本课题的研究意义
AtR78是编码拟南芥中的一种激酶，属于类受体蛋白激酶家族。有研究显示拟南芥R78的功能缺失突变体抗铝性显著增加，超表达后对铝敏感。CRISPR-Cas系统作为一种新兴的基因定点编辑工具已在多个植物中成功得到应用。本课题拟在杨树中克隆AtR78的同源基因，并对其CRISPR/Cas9基因编辑的靶位点进行分析，为构建CRISPR/Cas9植物基因编辑系统敲除杨树R78基因的表达载体，并进一步获得抗铝的杨树新种植提供基础。
参考文献：
