光合绿丝菌特有固碳途径涉及的膜蛋白的初步研究文献综述

 2022-08-05 15:30:35

光合绿丝菌特有固碳途径涉及的膜蛋白的初步研究综述

摘要：甲萘醌延胡索酸氧化还原酶即mQFR是嗜热绿色丝状产氧光合细菌的一种膜蛋白，一共有三个亚基，分别是74kDa的黄素蛋白含共价结合的黄素腺嘌呤二核苷酸、28kDa的含铁硫簇的多肽和一个27kDa的跨膜多肽，通过鉴定发现它是一个同二聚体的物质，相对分之质量大约在260kDa。mQFR在3-羟基丙酸循环中以黄素蛋白复合体的形式存在，催化琥珀酸转换为L-苹果酸，经分离纯化后发现该蛋白具有催化琥珀酸脱氢酶逆反应的作用，即可催化延胡索酸还原为琥珀酸。该发现对进一步研究3-羟基丙酸循环及联系线粒体呼吸链中复合物Ⅱ有重要的作用，同时为将来深入研究其结构和功能以及在绿色化工中的应用奠定基础。目前对mQFR的研究只在Chloroflexus aurantiacu光合菌中实现，而在与其亲缘关系相近的Roseifexus castenholzii菌种中还没有相关的研究。

关键词：甲萘醌延胡索酸氧化还原酶；3-羟基丙酸循环；Chloroflexus aurantiacu；Roseifexus castenholzii；嗜热绿色丝状产氧光合细菌

一、文献综述

在生物界中，大部分的自养生物都是通过光合作用的固碳作用，利用大气中的CO2将无机物转化为有机物得到碳源，从而生存繁衍，将太阳能变为化学能储存起来，把无机物变成有机物的同时还维持了大气的碳-氧平衡，缓解温室效应，净化空气保护环境，因此光合作用不仅在生物生存中有着重要的地位，在环境保护方面也起着一定的积极作用。在自然界中有多种固碳方式，已知的，在自然界中常见有六中固定CO2的方式[1-4]，分别是1、还原磷酸戊糖途径又称卡尔文循环，主要存在于绿色植物、绝大部分光合细菌和全部的好氧化能自养菌中；2、还原柠檬酸循环，这种固碳方式主要存在于紫色光合细菌和绿色硫细菌中；3、厌氧乙酰辅酶A途径，此途径主要存在于一些化能自养厌氧菌和古生菌中；4、3-羟基丙酸循环途径，主要存在于一些绿色非硫细菌的光合细菌中如橙色绿屈挠菌Chloroflexus aurantiacu、卡氏红弯曲菌Roseifexus castenholzii，两者都是嗜热光合细菌，且属于同一分支，都是真菌系内发展的很深的且是唯一的含光养性的分支；5、3-羟基丙酸/4-羟基丁酸循环；6、二羧酸/4-羟基丁酸循环，其中第5和第6种固碳方式主要存在于泉古生菌中。

第4点中的3-羟基丙酸循环[5]是近些年新发现的固碳途径，具体的循环过程及其中所存在的酶都还在研究中。3-羟基丙酸循环是绿色非硫光合细菌中的固碳方式，是一个双循环偶联的代谢过程即一个是以乙酰辅酶A为首的单循环和一个以乙醛酸为首的单循环的结合，具体地，乙酰辅酶A转换为中间产物3-羟基丙酸后再转换为并酰辅酶A，在此过程中固定第一个CO2分子；随后丙酰辅酶A再次固定一个CO2生成甲基丙二酸单酰辅酶A，再在酶的催化下生成琥珀酰辅酶A又再生成乙酰辅酶A和乙醛酸完成一个单循环；另一个单循环以乙醛酸为起始，利用前面循环中的丙酰辅酶A和L-苹果酰辅酶A/beta;-甲基苹果酰辅酶A生成beta;-甲基苹果酰辅酶A再经过一系列酶的反应生成S-柠苹酰辅酶A，最后在三功能酶的催化作用下再生成beta;-甲基苹果酰辅酶A和乙酰辅酶A完成双循环，同时生成终产物丙酮酸。该双循环一共有19步反应，其中涉及13种酶，且多是多功能酶并且这些酶还极具耐热性，可利用到工业生产中具有很大的研究意义和价值，循环中的关键中间代谢产物是3-羟基丙酸，其终产物是丙酮酸。3-羟基丙酸是一种具有三个碳原子的非手性有机酸，是一种具有黏性，无色无味，可溶于水、乙醇、乙醚的液体，它可以合成多种重要的化学物质，如丙烯酸、丙二酸，以及生物降解性塑料聚3-羟基丙酸，还可以作为食品或饲料的添加剂和防腐剂。目前3-羟基丙酸的合成主要通过化学合成和微生物合成实现，然而化学法使用不可再生资源，副产物多、分离困难、容易造成环境污染，因此近年来的研究热点逐渐聚焦到微生物方法上致力于实现低成本高效率的合成。丙酮酸是一种酸性较弱的有机酸，能在体内产生，是糖酵解途径的最终产物，在胞浆中还原成乳酸以供能，也可进入线粒体内氧化生成乙酰辅酶A，进入三羧酸循环，被氧化成二氧化碳和水，完成葡萄糖的有氧氧化供能过程。丙酮酸还可通过乙酰辅酶A和三羧酸循环实现体内糖、脂肪和氨基酸间的相互转化，因此，丙酮酸在三大营养物质的代谢联系中还起着重要的枢纽作用；同时有研究已表明,丙酮酸具有抗氧化作用[6]，能抑制鼠体内氧自由基的氧化作用,同时作为一种过氧化氢清除剂,具有防止自由基损伤的作用,已在心脏再灌注损伤和急性肾衰竭中证实具有保护机体抗功能性损伤，因此3-羟基丙酸循环的生物研究就有其重要的意义了。在3-羟基丙酸循环中涉及有黄素蛋白复合体一类的酶，是在以乙酰辅酶A为首的单循环中将琥珀酰辅酶A被催化生成的L-苹果酰辅酶A和琥珀酸中的琥珀酸催化为L-苹果酸，L-苹果酸再参与到原来的循环中即还可被琥珀酰辅酶A：L-苹果酸辅酶A转移酶激活，促使琥珀酰辅酶A再生L-苹果酰辅酶A和琥珀酸，其中的L-苹果酰辅酶A可以继续接下来的循环。但有研究发现在将此黄素蛋白复合体分离纯化后发现它还有将延胡索酸还原为琥珀酸酯的功能，这在3-羟基丙酸循环中发挥着重要作用。黄素蛋白复合体被分离纯化并鉴定后取名为甲萘醌延胡索酸氧化还原酶即mQFR。

目前已经在光合绿色非硫细菌Chloroflexus aurantiacus中分离纯化并鉴定了mQFR蛋白[7]，发现该复合物是一个二聚体的膜蛋白，每个单体有三个亚基，分别是一个74kDa的黄素蛋白，含有一个共价结合的黄素腺嘌呤二核苷酸，一个28kDa的含铁硫簇的多肽和一个27kDa的跨膜多肽，同时可以结合两个b型血红素和两个甲萘醌。通过SDS-PAGE检测该复合体的三个亚基分布大概在74kDa、25kDa和20kDa，同时通过Blue Native-PAGE的检测该复合物的分子量大小在260kDa处。通过xin[7]等人的研究，发现在Chloroflexus aurantiacus中该蛋白质分离纯化后的紫外吸收光谱值在还原状态下有三个吸收峰，一个大峰两个小峰，分别位于424nm、528nm和558nm，而在氧化状态下只有一个明显的峰值在415nm处。该蛋白在分离纯化后结晶得到了X射线衍射后分辨率为3.2Aring;的晶体，但其具体结构还在研究中。总所周知，在光合自养生物体体内需要进行光合和呼吸作用以维持能量供给，其中琥珀酸脱氢酶SQR在两者中扮演着重要的角色，在电子传递链中扮演复合体II传递电子，在TCA循环中和线粒体膜牢固结合，是三羧酸循环中唯一与内膜结合的酶，将琥珀酸氧化为延胡索酸从而继续糖的氧化。而在绿色丝状光合细菌，橙色绿屈挠菌Chloroflexus aurantiacu中存在的CO2固定途径即3-羟基丙酸循环中的膜蛋白甲萘醌延胡索酸氧化还原酶mQFR即为上述所说的黄素蛋白复合体，催化琥珀酸脱氢酶的逆反应，由此可知其可参与TCA循环和呼吸电子传递链，联系其他固碳途径，同时还可参与厌氧生物的节能机制，在光合生物的生化反应中具有重要的作用。有研究发现通过蛋白质序列比较发现QFR与琥珀酸-醌氧化还原酶(SQR)的序列相似，目前已用X射线晶体学方法解析了Wolinella菌的SQR、大肠杆菌的QFR、大肠杆菌的SQR以及线粒体的SQR的三维空间结构，表明SQR/QFRs类的蛋白质可能是由一个共同的原始祖先进化而来的，所以它们的总体蛋白亚基组成和辅助因子的方面具有高度的相似性。只是QFRs形成同二聚体，而SQRs形成同三聚体。由于亚基组成和结合的血红素数目的差异，SQR/QFR家族被分为五种类型。在不同类型中，B型的跨膜亚基(CP)具有单个多肽和2个B型血红素，而含有FAD的黄素亚基(FP)及含有铁硫簇的亚基(IP)在SQR/QFR家族中基本相似。从组成上看，Chloroflexus的mQFR复合物也类似于好氧的革兰氏阳性细菌枯草杆菌的SQR复合物，说明mQFR复合物是SQR/QFR超家族的一个新成员。由此可知QFR与SQR存在着一定的联系。但SQR/QFR的功能可能受到细胞能量状态的控制，且将SQR转化为QFR并不是一个简单的事件。因此最QFR的研究就有其必要性。

基于16S rRNA的物种进化树分析结果表明Chloroflexus与其他类群的光合细菌进化关系比较疏远。但Chloroflexus aurantiacus与Roseifexus castenholzii[9]的亲缘关系却非常近，属同一分支，同属绿色丝状不产氧光养细菌[11]都属含光养性分支，这点在光合作用上和进化中就具有重要的理论意义和研究价值。它们既可在无氧光照下生存又可在有氧黑暗中生存，且两种情况下的细胞状态并没有明显差别。此外，在光合体系形成期间没有细胞质膜的分化，这意味着在光合作用和呼吸作用中，电子都会通过一个与膜相关的电子传递链，其中就涉及到甲基萘醌这种醌类物质，而这种物质在Chloroflexus和Roseifexus中都有存在的。组成这种复合型电子转移链需要涉及多个跨膜蛋白质复合物，到目前为止其中的几个复合物包括QFR已在Chloroflexus中在蛋白质和基因水平上被鉴定，但QFR还没有在大多数光合物种中得到充分得纯化和表征，如有研究发现在Roseifexus castenholzii上发现b型细胞色素[8][10]存在于质膜中，但究其存在于哪个复合物中还不清楚，在Roseifexus castenholzii中的相关蛋白如QFR的研究也尚属空白，因此本次课题的研究就是填补这个空白，以Roseifexus castenholzii为材料，寻找甲萘醌延胡索酸氧化还原酶并对其进行分离纯化和结晶，为将来深入研究其结构和功能以及在绿色化工中的应用奠定基础，同时有以利于对3-羟基固碳途径的深入研究。

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