螺旋藻捕光天线藻蓝蛋白的分离纯化与结晶文献综述

 2022-08-17 09:24:18

文献综述

简介

螺旋藻是蓝藻门、藻蓝纲、段殖体目、颤藻科中的一个属，是一类低等的丝状多细胞蓝藻，具有蛋白含量高、 繁殖速度快等特点。内含一种特殊的色素蛋白——藻胆蛋白。这是一类存在于蓝藻细胞中的重要的光合色素蛋白复合物，在螺旋藻的生长过程中具有重要的生理、生化作用。根据藻种、生产周期、培养方式的不同, 其含量有较大的差异，一般认为，约占藻体干重的 10 %—28 %不等。藻胆蛋白根据吸收光谱特性的不同，主要可以分为藻蓝蛋白（C-pc）和别藻蓝蛋白（A-pc）。藻蓝蛋白是螺旋藻细胞中重要的光合作用天然色素。,由开链四吡咯化合物和脱辅蛋白通过硫链键结合。作为一种天然色素，色调为美丽的天蓝色。可用于食品添加剂以及化妆品中。同时还具有提高人体免疫力，促进动物血细胞再生的功能。藻蓝蛋白还是一种无毒，无副作用的理想光敏剂。此外，藻蓝蛋白还具有强烈的荧光性，可广泛应用于分子生物学，免疫学和细胞学等研究中。利用其天然的特殊荧光可作为荧光检测中的活性物质。应用前景十分广阔。但是，由于螺旋藻藻蓝蛋白的提取工艺较为复杂，且稳定性较低限制了其工业化生产。因此对螺旋藻中藻蓝蛋白的规模化提取和纯化的研究一

直是人们研究的焦点，其相应的技术也在不断创新和改进。

我国的海藻资源丰富，螺旋藻在我国也已经实现大规模的养殖，这为藻蓝蛋白的大规模提取和纯化提供了可能。鉴于近年来消费者对绿色，天然与健康的需求，以及藻蓝蛋白在医学，食品，医药，化妆品等领域广泛应用，势必会为藻蓝蛋白的生产创造一个巨大的市场。而反过来，需求的增长也会推进藻蓝蛋白提取纯化技术的开发与优化。供给之间，势必会为我国创造一个集生产，提纯及应用的生态链。因此，藻蓝蛋白的生产与应用在我国有着广阔的前景。

藻蓝蛋白的粗提方法

由于藻蓝蛋白（C-pc）是存在于单细胞微生物螺旋藻中的，属于胞内蛋白，要使其溶出必须先破坏螺旋藻的细胞壁与细胞膜。故提取过程中最为关键的是细胞破碎方法的选择。常用的细胞破碎方法有机械法与非机械法两大类。机械法中常用的有：珠磨法，超声破碎发，高压均质法。非机械法中常用的则是酶溶解法，化学渗透法和反复冻融法。在机械法中，超声破碎法常用于实验研究，但是处理的量比较小。而珠磨法和高压均质法则更适合规模化的破碎。非机械法中的酶溶解法和化学渗透法是目前实验室研究也相当活跃的方法。而反复冻融法则更适用于大规模化的细胞破碎。彭卫民等、韦萍等采用反复冻融的方法，然后通过离心收集上清液，得到大量的藻胆蛋白的粗品。

藻蓝蛋白的色谱提纯

相较于藻蓝蛋白的粗提技术，藻蓝蛋白的提纯技术，特别是规模化的提纯技术更为不成熟。而就这几年学者的研究方向来看，似乎在这方面的研究更为活跃。毕竟该技术直接决定了藻蓝蛋白产品化的可能性。在藻蓝蛋白的规模化提纯技术中，研究最多的就是色谱纯化技术。因为色谱技术是当今最为有效的蛋白质纯化技术，而且其易于放大和规模化的使用。而应用于藻蓝蛋白的色谱主要有：离子交换色谱和体积排组色谱。也就是我们所使用到的色谱技术。

离子交换色谱是根据电荷溶质与离子交换剂之间俺的静电相互作用力的差别进行溶质分离。因为藻蓝蛋白带负电荷，故研究时多采用阴离子交换柱对其进行纯化。在螺旋藻藻蓝蛋白的纯化时，研究者常使用离子 交换和体积排阻连用的方法。Chen T F，Reis A 均采用了体积排阻色谱和离子交换色谱串联使用的方法进 行螺旋藻藻蓝蛋白的纯化。Chen T F 等人采用弱酸性 的阴离子交换 DEAE-Sepharose Fast Flow 分离介质的色 谱柱，使螺旋藻蛋白的粗体液中藻蓝蛋白的纯化因子提高到 5.12，然后再采用体积排组色谱 SephacryS-300，进一步提高了纯化因子到 7.92，最终得到富硒的藻蓝蛋白的含量为 496.5mu;g/g。DEAE-Sephadex 系列柱料也是研究者[常采用的用于藻蓝蛋白纯化的填料，Patil G 等采用离子交换色谱与双水相萃取的结合的方法，对藻蓝蛋白进行纯化.采用DEAE-Sephadex 填充的phi;2.5cmtimes;15cm的阴离子交换色谱柱，使藻胆蛋白的纯化因子由1.18 提高到3.92. 并进行了规模化的放大，使进量体积为 1L 的藻胆蛋白粗体液经过离子交换色谱后得到相同的纯化因子，且收率为高达 73%, 并省去了沉淀，离心和透析等提取步骤。为规模化提取纯化藻蓝蛋白提供了可能。Carmen S S等采用Q-Sepharose Fast Flow填充的阴离子交换色谱(1.5cm times; 10cm)，经一步纯化，使粗提液的中藻蓝蛋白的纯化因子达到 2.2，纯度达到 93%。 可见阴离子交换色谱是规模化纯化螺旋藻蛋白的有效的手段之一。

藻蓝蛋白的结晶

前提说到的对藻蓝蛋白作为荧光标记探针的应用中，非常关键的一点就是对藻蓝蛋白结构完整性的保持。而想要较好的保持其完整性，我们选择比较温和的气相旋滴法进行结晶。原理便是利用上下液的盐浓度差使上层的液体减少从而使蛋白质有序的析出，即结晶。

Sy_PC结晶在6% PEG(聚乙二醇)4000，400mM MgSO4,和20mM三羟甲基氨基甲烷、液pH值,使用悬滴蒸汽扩散技术在20 c . Cryoprotection 30%乙二醇和70%的混合结晶储层是由flash冻结前浸泡。Se_PC在20% PEG 4000，50 mM tris pH8中结晶，Se_APC在30% PEG 4000，50 mM tris pH8中结晶，均在闪速冻结前在硅油中低温保护。

荧光性

C- 藻蓝蛋白包含了一个蛋白和一个发色团, 当藻胆蛋白从机体中分离纯化出来后, 由于经没有邻近的受体来转化收集过来的能量, 这种水溶性的亮颜色的胆蛋白就变得高度的荧光性[3] 。藻胆蛋白的光谱学和结构特性使得它具有独特的定性和定量特征, 如在可见光广泛吸收, 大的消光系数, 高度的荧光量子效能, 大斯托克斯位移, 藻胆蛋白中多重色团之间非常小的荧光猝灭。这些特性使得藻胆蛋白在作为荧光标记时大有前途。自从在 20 世纪 80

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