靶向VEGFR2融合蛋白的表达纯化及性质鉴定文献综述

 2023-01-05 19:14:30
  1. 课题背景及意义

癌症是目前影响全球人类健康的主要慢性疾病之一，它严重威胁着人类生命和社会发展。在我国，癌症列城市死因第1位，农村死因第2位。据世界癌症报告估计，2012年中国癌症死亡人数220.5万，约占全球癌症死亡人数的四分之一，已高于世界平均水平。必须引起重视的是，这趋势不但并未得到控制，反而有持续增长的势头。这些触目惊心的数字无疑为我们敲响了警钟。谈及癌症现状，全国人大常委会副委员长、中科院院士陈竺不久前表示：“中国正面临一场应对癌症的战争。”然而目前，我们对癌症的治疗方法仍然十分有限，完全治愈十分困难，很有可能会复发引发二次肿瘤[1]。

临床上治疗癌症的传统方法包括手术切除、放疗、化疗等方法。手术可以清除局部瘤体，但是由于它无法清除处于游离状态的癌细胞，大多数情况下无法达到根治的目的。放疗是一种物理治疗手段，它基于高能量的放射线可以杀害细胞的原理，可以针对某一病灶进行治疗，但同样无法杀死分布在血液系统的癌细胞。由于放射线的特殊性，也有可能在治疗过程中带来新癌变的发生，且由于副作用大，其疗效受到了很大限制。化疗相较于前两种手段，能作用于全身更多部位，但由于选择性差，毒副作用非常明显，还有可能产生耐药性，给治疗带来极大困难。这些传统治疗方法都面临着难以靶向杀灭癌细胞的问题。抗体因其能与受体特异性结合的特点，为肿瘤的靶向治疗带来了新方向，使针对性治疗成为可能。近年来，利用单克隆抗体治疗癌症取得了很大的成功。全长抗体相较于单链抗体、融合蛋白等，它的分子量较大，因此更容易引起机体免疫反应，且组织穿透能力相对较弱。单链抗体（scFv）虽然分子量较小，但在体内半衰期短，不能产生抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC），在临床上并不能满足需求。融合蛋白则不存在这些问题，为新的抗癌药物的设计提供了思路。

干扰素（interferon，IFN）是一类当病原体感染宿主细胞时，由宿主细胞合成并释放出的具有抗病毒、免疫调节、抗细胞增殖以及诱导细胞分化等功能的保护性细胞因子。目前，干扰素已经作为一种广谱抗病毒、肿瘤的药物在临床上广泛应用。作为抗肿瘤药物，干扰素可以通过下调周期素（cyclins）和周期素依赖性蛋白激酶（CDK）的表达，抑制细胞增生，促进细胞凋亡。且由于干扰素降低VEGF、b-FGF等血管生成因子产生的能力，它可以抑制肿瘤血管的生成[2]，从而减少恶性肿瘤侵袭、转移及术后复发的可能性[3]。其中，干扰素alpha;能通过激活P13激酶和（或）MAP激酶的信号转导途径下调HIF-1alpha;基因的表达，抑制VEGF的合成及分泌，达到减少肿瘤血管生成的目的。此外，干扰素还能调节免疫作用，加强T、B细胞和NK细胞的活性，加快抗体产生的速度[4,5]。然而，在干扰素应用于临床时，它较短的半衰期、诸多的不良反应（如头痛、发热、骨髓抑制、胃肠道反应等）和高剂量的使用常常使得许多患者不能耐受，限制了它的治疗效果。考虑到它的这些缺点，我们设计将干扰素alpha;和Mab04进行融合，获得靶向VEGFR-2的融合蛋白。

Mab04是本课题组成功在CHO细胞中表达的抗VEGFR-2全长抗体。血管内皮细胞生长因子VEGF(vascular endothelial growth factor)是一类直接作用于血管内皮细胞的细胞因子，是目前最有价值的抗肿瘤新生血管生成的研究方向[6]。肿瘤通过形成新生血管，从外界获取大量营养物质，同时也是肿瘤向恶性肿瘤转变必不可少的条件。VEGF以VEGFR-2为主要受体，人VEGFR-2又称KDR（kinase inserted domain containing receptor）。它在介导内皮细胞增殖、迁移、分化、微管形成、血管通透性增加等方面发挥重要的作用[7]，同时在乳腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、白血病等多种肿瘤细胞中都有高表达[8，9]。抗体作为一种天然存在于人体血液循环系统中的蛋白，其半衰期较干扰素更长，约为19天。因此，若将VEGFR-2作为一个高特异性的肿瘤治疗靶点，构建并表达出干扰素alpha;和Mab04融合蛋白，就不仅可能使干扰素alpha;针对病灶部位的癌细胞发挥作用，减少对正常细胞的伤害，降低毒副作，还能延长其半衰期，减少给药剂量，并且降低药物的免疫原性。和母体单抗相比，这个融合蛋白抗肿瘤活性也得到了加强。为此，我们计划表达纯化靶向VEGFR2融合蛋白，并对其性质进行鉴定。

参考文献：

1. M. Stockler, N. R. C. W., D. Ghersi R. John Simes. Systematic reviews of chemotherapy and endocrine therapy in metastatic breast cancer. CANCER TREATMENT REVIEWS 26, 18 (2000).

2. L Legros, J Guilhot, S Huault, et al. Interferon decreases VEGF levels in patients with chronic myeloid leukemia treated with imatinib[J]. Leukemia Research, 2014,38(6) 662-665.

3. VK Kommineni, CN Nagineni, A William, et al. IFN-gamma; acts as anti-angiogenic cytokine in the human cornea by regulating the expression of VEGF-A and sVEGF-R1[J]. BiocheIFNalpha;l and Biophysical Research Communications, 2008,374(3): 479-484.

4. Nausch N, Cerwenka A: NKG2D ligands in tumor immunity [J]. Oncogene, 27: 5944-5958, (2008).

5. Stefan Bauer,Veronika Groh,Jun Wu, et al. Activation of NK Cells and T Cells by NKG2D, a Receptor for Stress-Inducible MICA [J]. Science.1999，285 (5428): 727-729.

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