1.课题背景
以肿瘤血管内皮细胞为靶点抑制肿瘤血管生成从而阻断肿瘤血液供应已成为当前抗肿瘤生长和专一的研究热点。其中，VEGF/VEGFR2通路在肿瘤血管生成中起主要作用，抑制该通路能够抑制实体瘤的生长和转移。血管内皮生长因子（VEGF）是目前已知重要的血管生成促进因子。血管内皮生长因子受体-2 (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2,VEGFR2)存在于血管和淋巴管内皮等处，是VEGF的受体，与VEGF具有高亲和力，二者结合后可引发内皮细胞的一系列变化，促进肿瘤血管生成、浸润和转移。由于VEGFR-2的单克隆抗体与其发生特异性结合，阻断了VEGF与受体的结合，进而抑制了VEGF的促血管生长作用，因此在抗肿瘤方面发挥重要的作用。通过基因工程开发的IgG样抗体药物结构同人体内存在的天然抗体构象非常接近，因此降低诱发免疫原性反应风险。同时，IgG样全长抗体具有高特异性、高亲和力、体内半衰期长等特性，可以发挥更大的生物活性。
MHCⅠ类链相关分子(MICA) 属于MIC基因家族,位于MHC-I类区域, 具有高度多态性, 存在多种等位基因，正常情况下仅表达于上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞等表面。是自然杀伤细胞和T细胞上NKG2D受体的主要活化性配体,在上皮源性肿瘤细胞表面过表达。 MICA分子通过与NKG2D结合可传递活化信号, 活化T细胞、NK细胞等参与天然免疫的细胞，激活机体的免疫系统发挥作用，抑制癌细胞的发生和扩展。然而,临床观察表明,MICA会在肿瘤的增殖过程中脱落而形成可溶性MICA(s MICA),sMICA 可竞争性与效应细胞CTL、NK细胞表面NKG2D结合，导致NKG2D受体内吞和降解，使得CTL和NK细胞的NKG2D受体数目明显降低乃至消失，结果逃避了集体抗肿瘤的免疫反应，这被认为是肿瘤细胞逃脱NKG2D介导的免疫监视的重要原因。
本实验室之前利用制得的IgG1样全长抗体(Mab-04)，将Mab-04的重链恒定区C末端与MICA基因通过柔性肽连接获得融合基因，并且获得重组载体，然后将轻链和重链的重组载体两组按照一定的比例，进行交叉转染，筛选获得融合抗体，最终获得高亲和力、高靶向性的融合抗体。该融合抗体能够一方面能够利用抗原抗体反应特异性结合血管和淋巴管内皮等处的VEGFR-2，阻断VEGFR和VEGFR-2的结合，即切断了肿瘤部位血液供应。另一方面能够增加肿瘤部位的MICA含量，和MICA的受体NKG2D结合，减弱甚至消除因形成sMICA导致的免疫逃逸现象。具有非常强的抗肿瘤效果。
本课题考察不同基础培养基、流加物和基础添加物对工程细胞株生长和抗VEGFR2 全人抗体MICA融合蛋白表达量的影响。对融合蛋白的制备工艺进行优化，并进一步扩大发酵表达融合蛋白，通过Protein A纯化获得纯化蛋白，为将融合蛋白的后续开发应用作铺垫。
2. 实验目的
2.1 熟练掌握无菌操作、细胞培养技术。
2.2通过合理的实验设计，优化抗VEGFR-2 全人抗体MICA融合蛋白的制备工艺。
2.3 熟练掌握抗体的纯化、鉴定技术操作。
3.实验流程：
细胞培养
工艺优化
