肝素前体heparosan表达系统在枯草芽孢杆菌中的建立文献综述

 2023-02-02 22:16:14

开题报告内容：

一． 研究背景

肝素（heparin）是一种硫酸化酸性多糖，作为抗凝血剂在临床上广泛使用。肝素是由糖醛酸-（1→4）-D-氨基葡萄糖的重复二糖单元组成的线性多糖。此外，肝素还具有降血脂、抗炎、抗过敏、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤、抑制细菌黏附等作用，是重要的糖胺聚糖(GAG)类生化药物之一。

低分子肝素（low-molecular-weight heparin，LMWH）是一类以未分级肝素为起始物料经过分级或降解而得到的具有较低分子量的低聚糖混合物。它具有抗Xa活性，可抑制体内、体外血栓 和动静脉血栓的形成，但不影响血小板聚集和纤维蛋白原与血小板的结合。

目前，商品化肝素主要是从肠黏膜等组织中提取。2008年在HP使用中，曾因杂质过量出现严重的过敏反应甚至死亡。动物源性HP 的质量成为广泛关注的焦点，同时也引发了对非动物来源HP 的需求。在此背景下，细菌heparosan 的发现，引起了广泛关注。因为它使通过细菌合成，化学或生物修饰生产肝素、硫酸乙酰肝素(HS)成为可能。

肝素前体heparosan又称N-acetylheparosan，( -GlcUA-1，4-GlcNAc-1，4-)n(其中GlcUA 代表葡糖醛酸;GlcNAc代表乙酰葡糖胺)，是某些细菌荚膜中多糖骨架的二糖重复单位，同时也作为HP和HS的生物合成前体，在水螅和脊椎动物中都有发现。其二糖骨架结构虽与脊椎动物中的HP类似，但未硫酸化，也没有将GlcUA异构化为IdoUA。采用生物工程的方法，以heparosan为前体合成HP提供了一种新的、更为安全且较有希望的非动物源性生产方式。而目前，HP、HS 生物合成过程中所涉及的特异酶已基本克隆得到，已在E.coli中成功表达16 种参与其生物合成的酶。可实现以heparosan为前体，经NDST、C5-epi、2-OST、3-OST、6-OST 等酶修饰，合成HP和HS。所以，作为肝素生物合成起始底物的heparosan的制备逐渐进入研究的视野，引起了研究者们的兴趣。

二． 研究目的和意义

由于肝素前体heparosan对非动物源性方法生物催化合成肝素意义重大，并且目前利用微生物表达系统生产heparosan的巨大潜力以及此类研究仍处在探索阶段，所以有必要对heparosan表达的新型系统进行研究和开发。

本课题在对同类糖氨聚糖透明质酸微生物表达和来源于禽多杀性巴氏杆菌的heparosan合成酶pglA研究基础之上，利用基因工程技术向革兰氏阳性安全微生物枯草芽孢杆菌中引入heparosan合成酶表达基因pglA和heparosan合成途径关键酶基因tuaD、gtaB，并通过双载体的组合方式达到分别调控heparosan合成酶和合成途径关键酶的目的，以期获得可观表达量的产物heparosan，并且为进一步研究heparosan分子量调控机制，在体内合成低分子量heparosan打下基础。

三．实验内容

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