综述
恶性肿瘤发病机理不明确，晚期缺乏有效的治疗方法，是当今医学科技的世界性难题。肿瘤根据组织形态学可以被划分为多种不同的类型以及亚型。 而根据分子生物学来看， 肿瘤是由于某些染色体上发生了DNA损伤而导致细胞内基因的异常表达，因此导致细胞生长失控、缺乏分化和异常增生等一系列的基因疾病[1]。最近一些年以来， 随着癌基因和抑癌基因研究的深入，人们认识到，可能是由于一些共同的机制导致不同类型的肿瘤。对多基因和它们之间的相互作用，肿瘤的发生和发展中的差异表达，包括肿瘤抑制基因、激活癌基因，这些基因表达的变化，将参与并影响肿瘤细胞的功能，如细胞增殖、细胞间和细胞内信号转导、细胞周期调控和细胞凋亡等。因此，肿瘤相关功能基因的研究，我们可以了解肿瘤的遗传背景，更重要的是对肿瘤的预防、诊断和治疗意义深远[2]。临床资料表明，在肿瘤细胞中有一些异常的基因表达，基因表达水平的异常表达可能与肿瘤进展和转移密切相关[3]。临床资料显示，在肿瘤细胞中存在某些表达异常的基因，这些异常表达基因的表达水平可能与肿瘤进展和转移程度密切相。这些异常表达的基因可能会成为肿瘤免疫治疗的重要候选分子，并成为今后肿瘤免疫治疗关注的热点。
随着大规模基因表达谱技术的发展，这些发展为人们更加系统全面地研究肿瘤在基因表达上的特点提供了有效的技术，并由此产生出大量关于肿瘤基因表达及其蛋白分析的成果[4]。在本次实验中，我们通过与医院的合作，发现了多个在不同肿瘤细胞中异常表达的基因，并从中挑选出一个我们认为非常有潜力的基因，在将该基因克隆表达的基础上，构建原核表达系统，获得融合蛋白，为后续免疫动物，制备特异性的抗体奠定基础。
实验的主要过程是引物合成开始；从肿瘤细胞中提取总mRNA，利用RT-PCR法扩增目的基因cDNA；PCR产物的克隆[5]；构建原核表达系统；目的蛋白的表达、纯化及鉴定。下面就用到的主要技术做简单介绍：
- 引物合成 参照NCBI Genbnak公布的目标基因的全长序列，利用引物设计软件设计特意向的引物，再交由公司合成。
- RT-PCR RT-PCR技术包括：高质量RNA的提取：通常采用酸化异硫氰酸/酸/氯仿异戊醇提取直接或联合CCCL超速离心，在操作中应注意的RNA酶抑制剂和严格的操作使用，防止RNA降解。反转录过程：包括mRNA、dNTP、RNA反转录抑制剂转录系统，相位和逆转录酶，根据不同的酶的种类决定不同的反应温度、pH值和时间。引物和聚合酶链反应的设计：通过Genbank中的序列设计引物，引物的20-30bp长度，扩展长度为400bp，PCR扩增之前要检测确认PCR是预期的结果后的产物，主要方法有限制性图谱和DNA测序或Southern杂交[6]。
- 构建原核表达系统 以含有标记的质粒为载体，将回收的PCR产物和质粒均进行双酶切，回收纯化后进行粘端连接，连接产生的重组质粒来转化E.Coli菌，鉴定获取成功转化了的E.Coli菌[7]。
- 目的蛋白的表达、纯化及鉴定 根据蛋白质的功能特点，可以选择不同的方法模式来分离目标蛋白，一般采用离子交换柱层析、反胶团萃取、凝胶过滤、亲和层析等[8]。对蛋白质的分离纯化还很难使用独立的方法实现，通常需利几种方法综合应用[9]。
随着人类基因组测序技术的迅速发展和测序技术的发展，极大地促进了肿瘤的测序进展，对肿瘤分子多样性和不同肿瘤的共同特点有更多的了解。这些研究结果最终能达到临床获益，促进肿瘤患者的诊断和治疗还需要继续努力。选择合适的方法，充分利用信息资源，可以快速和有效地识别生物学和肿瘤相关基因的功能，从基因水平的肿瘤的性质，可以开辟一个新的肿瘤诊断和治疗方法。特异性基因研究为进一步研究肿瘤特异性基因在蛋白水平的表达提供了有力的依据[10]。本实验的目的是成功地在将肿瘤异常表达基因克隆表达的基础上，构建原核表达系统，获得融合蛋白，为后续免疫动物，制备特异性的抗体做好准备。
参考文献：
[1]欧晋平，朱平，马明信.基因差异法克隆肿瘤异常基因.国外医学输血及血液学分册，1997,20(3):137-139.
[2]杭栋，何忠虎.肿瘤基因组测序研究进展.肿瘤，2010,30(12):1077-1080.
[3]阮晓钢，李颖新，李建更，龚道雄，王金莲.基于基因表达谱的肿瘤特异基因表达模式研究.中国科学C辑生命科学，2006,36(1): 86-96.
[4]陆元志，姚运红，唐慰萍.表型克隆策略及其技术与肿瘤相关基因克隆.医学综述，2001,7(11):648-650.
