开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述不少于2000字）
- 拟研究或解决的问题
将来源于古生菌Methanococcus jannaschii的酪胺酰-tRNA合成酶（TyrRS）在大肠杆菌中进行表达同时将其纯化出来探索该酶对D-Phe的体外催化能力。
- 采用的研究手段
- 基因克隆和载体构建；
- 异源蛋白质在大肠杆菌体内表达；
- 蛋白质的表达和纯化
- 文献综述
- 非天然氨基酸插入蛋白
蛋白质作为所有生物体的功能体现者在生命体系中扮演着极其重要的角色。他们不仅是细胞结构的构筑单元和细胞新陈代谢的催化剂而且在细胞内、外信号传导细胞形态学和稳定性中都发挥着非常重要的作用[1]。原则上化学家和生物化学家已经能够合成任何有机小分子，但是操纵和改变蛋白质组分的手段还相当有限。对于大多数的蛋白质来说目前所能改造的仅仅局限于构筑蛋白质的基本单元——20种天然氨基酸。而非天然氨基酸具备某些优良的特性比如：荧光性质、光敏感、氧化还原活性。甚至也可以将某些带有特殊化学基团和生物基团的氨基酸引入到蛋白质中例如：酮基叠氮基炔基或者含有重金属侧链的氨基酸。通过嵌入这些非天然氨基酸可实现蛋白质的新功能并达到按我们需要设计功能蛋白质的目的。
- 基因工程技术
基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。所谓基因工程是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。
基因工程的基本原理是在体外将不同来源的 DNA 进行剪切和重组，形成镶嵌DNA分子，然后将之导入宿主细胞，使其扩增表达，从而使宿主细胞获得新的遗传特性，形成新的基因产物[2]，它有3个基本的步骤：①从合适材料分离或制备日的基因或 DNA片段；②目的基因或 D N A 片段与载体连接作成重组DNA分子；重组DNA分于引入宿主细胞，在其中扩增和表达。不同种类生物的生物学特性不同，其基因工程在操作上和具体技术上必然有所差异，但技术核心都是DNA的重组，即利用一系列的 DNA限制性内切酶、连接酶等分子手术工具，在某种生物 DNA 链上切下某个目标基因或特殊的 DNA 片段，然后根据设计要求，将其接合到受体生物 DNA 链上。
- 遗传密码扩增技术
2001年美国Scripps研究中心的Peter G Schultz教授领导的研究小组率先在科学杂志发表了在大肠杆菌蛋白质翻译过程中掺入对对甲氧基苯丙氨酸的文章[3]为合成含非天然氨基酸的蛋白质提供了新方法。这些非天然氨基酸带有酮基[3]、叠氮基[4]、炔基[5]、光敏性基团[6]等已经被广泛应用于酶的结构和功能细胞内信号转导和胞内蛋白质荧光定位等相关研究。
遗传密码扩充技术主要依赖能在细胞内表达的一对外源的氨酰tRNA合成酶和抑制型的tRNA分子对。来源于Methanococcus jannaschii（Mj）的酪氨酰tRNA合成酶就是其中一种，这些分子对有以下5个特点：
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- 抑制型tRNA只能被特异性的aaRS所识别而不能被宿主内源性的合成酶识别；
- 特异性的aaRS只能识别非天然氨基酸而不识别20中常见氨基酸；
- tRNA和特异性的aaRS必须由宿主自身表达；
- aaRS反密码环结合结构域较小使得其能容忍tRNA反密码环的突变抑制型tRNA与aaRS主要识别的元素一般为氨基酸臂上碱基对而非反密码环；
- aaRS缺乏CP1结构域编辑活性较弱等。
- 氨基酰-tRNA合成酶(AARS)
氨基酰-tRNA合成酶为蛋白质生物合成过程中的一类关键酶，其底物为氨基酸、tRNA和三磷酸腺苷(ATP)。通常细胞中含有20种AARS，每一种AARS对应于一种氨基酸和相应的tRNA，AARS催化相应tRNA的氨基酰化，氨基酰化的tRNA通过tRNA的反密码子与mRNA上的密码子配对在核糖体上将氨基酸依次连接，合成蛋白质。如果AARS对氨基酸和tRNA 的识别发生错误，生物体则会产生混乱，所以AARS对氨基酸和tRNA识别的专一性及精确性对从基因翻译为蛋白质的忠实性是十分重要的，例如人类许多疾病的发生与蛋白质生物合成精确性的失控有关。通过抑制AARS的活力，还可以抑制某些病原菌的蛋白质生物合成而抑制病原菌的生长，为人类设计新型药物提供新思路。因此，研究AARS不仅具有重要的生物学意义，而且随着研究的深入还可以应用于人类疾病的防止，服务于人类的健康和改善人类生存环境。
利用遗传密码扩增技术，马海荣等人[8]采用来源于Methanococcus jannaschii（Mj）的对腈基苯丙氨酰tRNA合成酶（pCNFRS）-tRNA，将D-Phe成功引入到绿色荧光蛋白GFP中，插入D-氨基酸的GFP稳定性增加，光谱性质发生了改变，但是插入D-氨基酸的蛋白质表达量较低，不能满足后期实验的需要，所以为了提高D-氨基酸引入蛋白质的效率，本课题拟对来源于古生菌Methanococcus jannaschii的酪胺酰-tRNA合成酶（TyrRS）进行研究，在大肠杆菌中使其进行表达同时将其纯化出来探索该酶对D-Phe的体外催化能力。
参考文献：
