开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
课题背景
VEGF，即vascular endothelial growth factor，也称VEGFA或VEGF-A，中文名为血管内皮生长因子，是一种可以强烈诱导血管生长的因子，在血管生成过程中起重要作用。VEGF可以促进内皮细胞增殖，促进细胞迁移，并抑制细胞凋亡。肿瘤细胞在低氧(hypoxia)情况下可以分泌VEGF。癌细胞的生长、转移依赖新生血管的形成,血管内皮生长因子(VEGF) 是最有效的促血管生长因子。以VEGF 及其受体VEGFR 为靶点治疗癌症是药物研究的热点。
血管内皮生长因子（VEGFs）调节血管的发展，是通过结合到受体促进血管和淋巴管生成。研究表明受体VEGFR - 1对于造血干细胞的招募和单核细胞和巨噬细胞的迁移具有重要作用； VEGFR – 2能够调节血管内皮功能；VEGFR - 3调节淋巴管内皮细胞的功能。1990年，美国哈佛大学Folkman博士提出著名的Folkman理论，即肿瘤组织生长，必须依靠新生血管生成来提供足够的氧气和营养物质来维持。被认为是针对VEGF临床应用的基础。 目前，以VEGF为靶点，医学应用向两个方向跨步发展： 2004年2月26日，美国罗氏生产的通过抑制VEGF作用机制的肿瘤治疗药物阿瓦斯汀获得FDA的批准。 2011年2月14日，由北京健平金星生物科技有限公司生产的对人体VEGF浓度的测定的检测试剂，“血管内皮生长因子检测试剂盒”（VEGF-KIT)获得中国政府批准。
本实验室在前期得到一种全人源VEGF单克隆抗体，但相较于AVASTIN亲和力低，前期实验基于模建的抗体结构使用计算机辅助手段，设计了六个突变位点，其亲和力常数分别为原抗体的 0.5934倍、0.3859倍、1.0100倍、0.6072倍、1.4432倍和0.1725倍，其中抗体重链上52位的天冬酰胺突变为天冬氨酸后，亲和力提高了1.4432倍。在此基础上选择抗体重链上52位的天冬酰胺突变为天冬氨酸及100位组氨酸突变为谷氨酸，进一步通过实验的方法测定突变抗体的亲和力。
研究意义
对前期研究的VEGF165全人源化抗体单突变抗体表达及活性测定的实验方法进行优化，对抗体进行重链双突变位点的改造及高表达，并对突变后的抗体活性进行检测。拟提高该抗体的VEGF抗原结合活性，增强抗体对VEGF靶点的作用效果，来抑制肿瘤细胞的生长及迁移。为未来开发针对VEGF的抗肿瘤药物提供理论依据。
试验流程
1.突变体构建
通过计算机辅助设计获得的定点突变位点，以实验室获得的抗体重、轻链质粒pcDNA3.0-H和pcDNA3.0-L为模板，采用重叠延伸PCR定点突变技术快速准确地构建抗体的突变体。根据重叠延伸PCR定点诱变技术的原理[1]，如图1。本文构建了双位点突变体，以单位点突变体为例。采用Primer Premier 5.0软件设计4条引物（如表3-1）：F和R为侧翼引物，用于扩增全长启动子片段；TBR和TBF为两条引入了突变位点且完全互补的引物，用来互补引物F和R扩增突变位点及其两侧的启动子片段。
