开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
抗肿瘤蛋白NM23-H2在甲醇酵母系统中的克隆表达，纯化及其体外生化活性探究
研究背景：众所周知，肿瘤转移对于肿瘤的发生发展具有很关键的作用。阻断肿瘤转移将极大地降低肿瘤发展的活力，从而达到治疗延长患者生存期的目的。nm23基因是人类发现的第一个肿瘤抑制基因，由 1988 年美国国立癌症研究所的 Steeg等人首次发现并命名的。该基因广泛存在于包括细菌、酵母、植物、果蝇、鼠和人类在内的多种生物物种中，是一个具有高度同源性的保守基因家族。
研究意义：迄今为止，nm23基因家族已经发现了9个成员，分别是nm23-h1到nm23-h9, 它们编码11个蛋白。其中又以nm23-h1和h2为发挥转移抑制的主要基因，但是h1的编码产物NM23-H1的抑制活性要显著强于h2的编码产物NM23-H2。h1和h2在编码区存在高同源性，但是活性差异过大。NM23-H1已经分离纯化完成，目前缺少NM23-H2的样品，所以本课题致力于在甲醇酵母系统中克隆表达NM23-H2，以利于后续生化机制的探究。
研究现状：根据发生系统和线性序列，nm23基因家族又可以分为两组。第一组包括nm23-h1~nm23-h4，第二组包括 nm23-h5~nm23-h9。其中，第一组具有类似的基因组结构和由4~6个单聚体折叠而成的三维结构，其NDP激酶区域都具有催化活性。第二组的基因序列存在较大的差异，编码蛋白的活性区域也不是严格的保守位点。因此，除nm23-h6外，第二组，只具有NDP结构区域而缺乏NDP激酶活性，此外，nm23-h5,h7,h8,h9都表现出组织特异性，主要分布于睾丸与精母细胞中。
1989 年，Rosengard 等发现了nm23-h1基因, 国内外许多实验研究证明， 在人类的许多恶性肿瘤中nm23-h1等位基因的缺失与肿瘤转移潜能呈明显负相关。nm23基因的肿瘤转移抑制作用主要由nm23-h1发挥的。
1991 年，Stahl 等用鼠pnm23筛选人类成纤维细胞 cDNA文库时发现了nm-h2基因. nm23-h2基因定位于17号染色体 (17q21 .3~22)，与nm23-h1基因相隔4kb。所编码的蛋白产物其氨基酸序列与nm23-h1基因产物有88%的同源性，其蛋白高保守区有98%同源性，而两基因在3rsquo;、5rsquo;端非翻译区核苷酸序列同源性不到50%。nm23-h1和nm-h2基因编码蛋白与核苷二磷酸激酶 (NDPK)的a、b亚基分别相对应，编码蛋白的氨基酸序列与NDPK亚基的同源性分别为89%和97% ,其分子量分别为17143D 和 1729D。nm23-h2基因被认为具有上调 c-myc的转录因子的作用, 可能在细胞增殖方面发挥作用。Postel等研究证明 nm23-h2蛋白就是c-myc基因转录因子。
nm23基因是一个多功能基因，除了具有肿瘤转移抑制作用，对细胞的增殖、分化、个体发育也具有调控功能。这些功能可能是由nm23蛋白参与微管聚合与解聚、囊泡运输和信号转导等过程介导的。nm23家族蛋白产物都具有NDPK活性，能通过一种乒乓机制将 5rsquo; NTP的gamma;-磷酸基团转移到5rsquo; NDP上。因此推测nm23基因以NDPK介导的转磷酸作用为微管聚合和解聚提供必须的 GTP, 并对正常的纺锤体形成有维持作用，若nm23基因发生变化则容易导致癌细胞染色体非整倍体的形成，促进肿瘤的发生。在9个家族成员中，转移抑制功能主要由nm23-h1和nm23-h2体现，而二者相比, nm23-h1又发挥着主导的作用。
前文提及，nm23-h1与nm23-h2编码序列存在高度同源性，如何通过结构差异判断出生化性质差异是阐释nm23-h1和nm23-h2的转移抑制作用机制的关键。课题组已经克隆表达了nm23-h1,目前缺乏的是nm23-h2的工程酵母，待构建成功后将共同进行nm23-h1和nm23-h2的体外生化性质对比。所以本课题将致力于构建nm23-h2的工程酵母，克隆表达NME2，并完成分理纯化工作，以利于后期机制的阐述。
参考文献：
