文献综述
自发或诱变病理模型需要漫长的时间，利用ES打靶技术制备的人源化小鼠模型将有效的提高实验研究的周期。通过ES打靶技术将正常基因引入病变细胞，取代原有异常基因或对缺陷基因进行精确修饰，使修复后的细胞表达正常蛋白，这已经成为治疗基因缺陷性疾病的一种手段。小鼠因体积小，易维持与操作，繁殖周期短，与人在基因组和生理学等特征方面相似，通过ES打靶技术修饰后，可以使其成为广泛应用的临床前动物实验模型。
ES打靶技术是指应用一段与胚胎干细胞染色体上一段序列具有高度同源性的外源DNA，通过同源重组技术，将目的基因在动物个体中的活性完全消除的技术。相对于其他改变小鼠基因的方法，ES打靶技术在充分利用现有小鼠和人基因组序列的基础上，可以控制调节遗传位点的选择。ES打靶技术可以在任何位点实现精确重组，克服了随机整合的盲目性和危险性，具有将大片段和复杂序列敲入，打靶效率极高且不易脱靶等优点，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法[1] 。ES打靶技术在医学和生命科学发展过程中起到了重要作用。
利用ES打靶技术中条件性基因敲除的方法制备人源化小鼠，通过Cre-Loxp重组酶系统在特定时间获得目的小鼠。Cre重组酶是一种位置专一性酶，它可以催化称为Loxp位点的34个碱基对基因序列之间的重组[2]。这样在目的基因编码框两侧引入重组酶Cre的识别位点Loxp。当带有Loxp基因的小鼠与表达重组酶Cre的小鼠交配，后代小鼠的目的基因因为Cre重组酶的存在而被改造[3]。在筛选阳性ES细胞时使用正负向筛选系统。同源重组时只有载体的同源序列以内的部分会发生重组，以外的部分将被删除。因此，构建载体时要将正负向筛选基因整合到载体中。实验中用到的正向筛选基因主要为neo基因，抗性药物为G418，是一类氨基糖苷类抗生素。当阴性细胞没有整合到neo基因时，该类细胞不会对G418产生抗性，因此阴性细胞会被杀死。负向筛选基因为胸苷激酶基因（tk基因），同源重组时，tk基因会被删除，而随机插入时tk基因会被保留，此时，胸苷激酶蛋白（TK）会使鸟嘌呤变为毒性核苷酸，从而杀死细胞[4]。
成纤维细胞活化蛋白alpha;（Fibroblast activation proteinalpha;,FAPalpha;）在肿瘤微环境中发挥免疫抑制作用。FAPalpha;是一种跨膜丝氨酸蛋白酶，在90%以上的上皮性肿瘤间质中高度表达[5]。该项目利用ES打靶技术与同源重组技术，通过构建含有人体FAP基因的载体，将含有目的基因的载体通过电转的方法转染到ES细胞，通过正负向筛选的方法获得具有阳性克隆的ES细胞，再将ES阳性细胞通过显微注射的方式注射进入小鼠囊胚。该实验现已将胚胎成功移植到代孕鼠的子宫，即将获得含有FAP目的基因的一代小鼠。
参考文献：
[1]汤富磊,冯娟.小鼠基因修饰基本原理及其在医学研究中的应用——2007年诺贝尔生理学或医学奖及其相关工作介绍[J].生理科学进展,2008(03):282-288.
[2]王又红.基因敲除技术的应用现状与发展前景[J].国外医学(寄生虫病分册),1999(05):196-199.
[3]丁海峰,李小申,黄慧,苑丽.基因敲除技术研究进展[J].黑龙江畜牧兽医,2018(05):50-54.
[4]李珊珊,安书红,刘昱辉.植物基因打靶中正负筛选系统的研究[J].中国农业科技导报,2011,13(06):41-45.
