一、文献综述
细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是细胞膜源性的小室，其可以由许多细胞和组织自然分泌，Evs的分泌与许多疾病的发病机理密切相关，因此Evs已经成为疾病诊断和早期肿瘤检测的生物标志物[1]。有关研究表明Evs可以作为新型的药物载体用于药物的靶向传递。尽管合成纳米粒子及其表面生物共轭用于靶向药物传递的相关工程有所进展，但现代的纳米粒子生物功能化仍然不足以复制自然界中复杂的细胞间相互作用[2, 3]，因此不可能避免合成纳米粒子的外源特征暴露于免疫系统中，但膜源性的Evs可以远距离传输货物，并且含有许多促进细胞间相互作用的膜蛋白，加之其本身的纳米结构，因此可以作为药物传输的优良载体。
真核细胞以及原核细胞都可以产生Evs，我们主要介绍的是原核细胞产生的Evs。革兰阳性菌有一层单一的脂质膜以及被由肽聚糖层和胞壁酸组成的细胞壁所包被[4]，而革兰阴性菌的膜结构由双层膜（内膜与外膜）、肽聚糖层和周质组成[5]。所以相比较革兰阴性菌直接从外膜释放Evs，也叫外膜囊泡（outer membrane vesicles,OMVs），来源于革兰阳性菌的Evs从内膜释放并穿过细胞壁,但二者Evs的结构、尺寸是类似的，均为球形双层脂蛋白纳米结构，通常包含有生物活性蛋白、脂质、核酸以及代谢物等。它们在功能上也有异曲同工之妙，都参与细菌与细菌间、细菌与宿主间的相互作用，对于病原菌的发病机制及细菌本身的生长有重要作用[6]。比如进行水平基因的转移从而传递抗生素耐药性，杀死竞争细菌、摄取营养促进细菌存活，传递毒力因子致宿主发病，有助于细菌粘附和侵入宿主，介导宿主细胞的调控，参与免疫逃逸以及免疫调节等。但它们的Evs也是可以区分的，革兰阴性菌的Evs包含着典型的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）以及周质成分[7]。
由于Evs包含组分以及其可以荷载抗原的特性，其作为疫苗的研究也有了很大的发展。比如MenB （Meningitis type B）OMV疫苗，对于N.mentingitis的几个血清组，包含耦合载体蛋白的荚膜多糖的结合疫苗已经进入市场，已证明，MenB OMV疫苗的疗效范围在83-85%，并通过了第一阶段、第二阶段和多项临床研究[8]。现代研究中，通过基因工程技术，负载合适的抗原以及具有靶向作用的蛋白分子，可以用于肿瘤疫苗的开发。
在目前的肿瘤治疗中，大方向上依旧是综合治疗，特别是正对晚期病人，而放疗、化疗仍是主流的治疗方法，对于实体瘤，手术切除也是重要的治疗方法，其中放疗属于局部治疗，其治疗效果取决于放射敏感性，多用于手术后残余肿瘤的消除，副作用大，化疗属于全身性治疗方法，但缺乏靶向性，易产生耐药性，与化疗一样副作用大，而手术治疗往往适用于早期肿瘤的发生，且易产生肿瘤复发的问题。目前一些新兴的肿瘤疗法也已经有了很大的发展，光动力疗法是特定波长的激光照射使肿瘤组织吸收的光敏剂受到激发，而激发态的光敏剂又把能量传递给周围的氧，生成活性很强的单态氧，单态氧和相邻的生物大分子发生氧化反应，产生细胞毒性作用，进而导致细胞受损乃至死亡。而光热疗法是利用具有较高光热转换效率的材料，将其注射入人体内部，利用靶向性识别技术聚集在肿瘤组织附近，并在外部光源（一般是近红外光）的照射下将光能转化为热能来杀死癌细胞的一种治疗方法。两种方法都具有一定的靶向性，并且不会产生耐药性，对肿瘤类型无限制，副作用小、疗效好等。另一个肿瘤治疗的大方向是免疫治疗，机体的免疫系统在正常的情况下可以区分“自我”和“非我”，肿瘤细胞作为“非我”，理论上免疫系统可以识别出来，并采取措施杀死肿瘤细胞。但肿瘤细胞总会产生有利于逃避免疫系统的突变，从而躲过监测，在机体中繁殖生长。所以许多刺激机体免疫系统，摧毁肿瘤细胞免疫逃逸机制的药物和治疗方法应运而生，比如PD-1抑制剂Keytruda，CAR-T疗法，肿瘤疫苗等，它们都表现出了抗肿瘤效果，并具有优良的发展前景。但随着科技的发展，一些更加综合的治疗概念也已经被提出和研究，比如采用肿瘤细胞胞外囊泡负载光热传达材料，可有效地结合免疫治疗以及光热治疗的优点，同时有研究表明，光热治疗对肿瘤组织产生的影响还包括，促进肿瘤抗原的暴露，增强肿瘤免疫原性死亡[9]，并在动物实验中展现出极好的抗肿瘤作用[10]。
二、研究内容
本课题的研究主要是基于光热疗法研究一种外膜囊泡负载光热传导材料的肿瘤治疗制剂，长双歧杆菌（Bifidobacterium longum，BL）作为一种生理性有益菌，对人体健康具有生物屏障、营养作用、抗肿瘤作用、免疫增强作用、改善胃肠道功能、抗衰老等多种重要的生理功能。因为其是有益菌，所以采用其产生的Evs作为载体，最大程度上减少对机体的影响。吲哚菁绿（Indocyanine green，ICG）是一种经批准的近红外菁化染料，它的近红外吸收峰大约在800nm，这种波长的激光可以穿透组织，所诱导的效应不仅可以为光动力效应，也可以为光热效应。因此ICG可以作为肿瘤治疗的研究材料，但游离的ICG不能达到期望中的治疗效果，因为其在水溶液中的不稳定及自我聚集特性，在机体内非特异性结合蛋白质可以导致其快速聚集和消除，不能产生靶向作用[11]。为了解决上述问题，我们用BL产生的Evs作为载体，去包裹ICG，从而提高其稳定性、肿瘤靶向性，延长其在循环系统中的时间，避免其与蛋白质的非特异性结合。所构成的BL-EV-ICG制剂，进入循环系统后，可穿过血管聚集到肿瘤组织中，因为肿瘤血管本身的不成熟性质，比如不规则、窦状壁薄、基底膜厚薄不一、内皮细胞间连接松散，部分毛细血管甚至缺乏内皮细胞等，会使BL-EV-ICG在循环过程中，趋向于聚集在肿瘤组织区域，达到肿瘤靶向的效果。在适当的循环时间后，用800nm左右的激光照射肿瘤组织，从而使富集在肿瘤中的ICG发挥光动力和光热效应，达到杀伤肿瘤细胞的作用。
三、研究手段
（1）、建立高效培养BL的技术
购买相关菌株；培养基名称：JCM13；培养基成分：肉汤提取物 3g，月示蛋白胨 10g，胰蛋白胨(BBL) 5g，植酮(BBL) 3g，酵母粉 5g，肝浸出物 150ml，葡萄糖 10g，可溶性淀粉 0.5g，溶液A 10ml，溶液B 5ml，吐温80 1g，琼脂 15g，5%L-半胱氨酸盐酸盐溶液 10ml，马血 50ml，蒸馏水 825ml。pH=7.2。培养温度为37℃。
