文献综述 阿霉素是目前临床常用的蒽环类抗肿瘤药物，适用于急性白血病，恶性淋巴瘤、乳腺癌等。，可抑制RNA 和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。主要适用于急性白血病，对急性淋巴细胞白血病及粒细胞白血病均有效，一般作为第二线药物，即在首选药物耐药时可考虑应用此药。恶性淋巴瘤，可作为交替使用的首选药物。 P53基因 人体抑癌基因。该基因编码一种分子量为53kDa的蛋白质，命名为P53。p53基因的失活对肿瘤形成起重要作用。但是事物必然有它的两个方面，p53是一个重要的抗癌基因使癌细胞凋亡，从而防止癌变；还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。这种功能对于受化疗药物作用而受伤的癌细胞，则起修复作用，而不是使癌细胞自杀。造成被修复的癌细胞在治疗后成为新的肿瘤。抑癌基因p53的表达能够抑制人乳腺癌细胞MCF-7的生长,并可能通过阻抑cyclinD1和CDK2的表达而阻抑细胞周期S期进程,实现其调节功能。 实验方法 细胞培养 人乳腺癌MCF-7 细胞单层接种在含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培养液中, 在37 ℃、5% 二氧化碳培养箱中培养。 细胞生长抑制实验 取对数生长期的MCF-7 细胞, 以细胞数1.5times;104/孔接种于96 孔板。培养24 h后, 加入不同浓度的阿霉素; 或在加入不同浓度抑制剂1 h 后, 加入60 mu;mol·Lminus;1 阿霉素。每组设置3 个复孔, 同时设置阴性对照。置于培养箱中继续培养至不同时间点, 每孔加入5 g·Lminus;1 MTT 10 mu;L 再培养3 h 后, 吸弃上清液, 每孔加入DMSO 150 mu;L 溶解, 于酶标仪492 nm 处测定各孔吸收度 (A) 值。用MTT法检测抑制率,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡及凋亡相关分子根据公式计算抑制率: 抑制率 (%) = [A492(阴性) minus;A492(给药)] / [A492(阴性) minus; A492(空白)] times; 100% Hoechst 33258 荧光染色分析细胞凋亡时DNA的变化 取MCF-7 细胞, 以细胞数5times;105/孔接种于6孔板中。细胞爬片24 h 后, 加入60 mu;mol·Lminus;1 阿霉素作用48 h 后, 去培养液, 用PBS 洗1 遍。去PBS后, 用4%多聚甲醛固定1 h。去多聚甲醛后, 用PBS洗2 次, 加入终浓度为5 mg·Lminus;1 的Hoechst 33258 染色30 min, 封片。于荧光显微镜 (激发波长为350 nm,发射波长为460 nm) 下拍照。流式细胞仪分析细胞凋亡率[9] 取MCF-7 细胞,以细胞数1times;106/瓶分瓶, 培养24 h 后, 加入不同浓度的阿霉素; 或在加入不同抑制剂1 h 后, 加入60mu;mol·Lminus;1 阿霉素, 作用相应的时间。收集细胞, 用PBS 清洗1 次。70% 乙醇固定过夜, 次日将单细胞悬液离心弃去固定液, 用PBS 洗涤1～2 次, 加入50mg·Lminus;1 (0.1 g·Lminus;1 RNase A, PBS 配制) PI 染色液1.0mL, 置4 ℃避光染色1 h; 或根据Annexin V-FITC/PI染色试剂盒说明书操作后, 用流式细胞仪分析测定细胞内DNA 分布情况。 Western blotting 1.样品准备 ⑴提细胞蛋白（冰上操作）：a预冷的PBS洗3遍，将孔或培养瓶里的PBS吸干净；b加入蛋白裂解液，六孔板一个孔加200uL，培养瓶加400uL；c裂解5min；d细胞刮刀轻轻刮细胞，确保每个部位都刮到；e吸取上清到1.5mL EP管中；f裂解10min；g 12000转，离心10min；h上清转移到另一EP管中，-20度保存（若需长期保存（半月以上），则存于-80度冰箱）。⑵ 提组织蛋白（冰上操作）：a剪一小块组织（绿豆大小）于玻璃匀浆器中；b加500uL蛋白裂解液，匀浆；c转移匀浆液于1.5mL EP管中；d12000转，离心10min；e转移上清到另一EP管中；f通常组织蛋白的各样品浓度相差很大，定量结果不准确，这样western做出来的内参肯定不一致，所以调整蛋白至同一浓度（通常调整为2mg/mL），将蛋白液-20度或-80度保存 2.蛋白定量a配工作液，50:1配制；b做标曲，按下表加标准液；
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纯水（uL） |
10 |
7.5 |
5 |
2.5 |
0 |
|
BSA标准液（uL） |
0 |
2.5 |
5 |
7.5 |
10 |
|
浓度（mg/mL） |
0 |
0.5 |
1 |
1.5 |
2 |
c加样品，通常2倍稀释（5uL纯水/5uL样品）；d各孔加200uL工作液，37度培养箱孵育20min；e孵育好之后冷却至室温（约2min）；f酶标仪562nm波长下检测吸光度值；g做标曲，将各样品吸光度值代入标准曲线，即可得到各样品蛋白浓度h 取30ug各蛋白样品，加入loading buffer，煮沸5min，离心即可。3. 配SDS-PAGE胶先配分离胶，胶的浓度根据目的蛋白分子量而定，分子量越大，胶的浓度越低，分子量越小，胶的浓度越大。大概30min之后可以开始配浓缩胶。灌胶后及时插梳子（浓缩胶易凝）。 4 .跑胶装好跑胶仪，加上电泳缓冲液，注意观察是否会漏液。如果漏液的话，需要卸下玻璃板重新装配。跑胶时浓缩胶一般60V，分离胶120V。注意正负极不要插错。接上电流后，注意看跑胶仪的底部，可以看到细小的泡泡向上升，这就表明已经开始跑胶，且正负极正确。另外，跑胶几分钟后，即可看到样品的上缘慢慢往下压。5.转膜根据预染MARKER的位置，切下所需的胶，把胶浸入转膜缓冲液中。把转膜仪的夹子打开，黑色一边朝下（负极），垫上一层海绵，一层滤纸（BIORAD原配滤纸，如果是用自行剪的普通滤纸，则需要上下各5张），把胶铺在滤纸中央，可以倒一点点缓冲液，量胶的大小，剪下所需大小的PVDF膜，把PVDF膜浸入甲醇激活15s以上。将PVDF膜盖在胶上，再盖上一层滤纸，一层海绵然后把夹子合上，夹好，注意不要移动中间的夹层，按正负极的位置放进转膜仪。将转膜缓冲液倒入转膜仪中，使转膜仪内部充满在缓冲液的环境中。盖上盖子（注意正负极），把转膜仪放在冰水浴中，110V，50min。6.封闭取出PVDF膜，10%牛奶封闭液封闭20min，摇床上震摇。7.一抗PBST稀释抗体，4度过夜或室温2h，一抗孵育好后PBST洗3次，每次10min。8.二抗PBST稀释抗体，室温1h，二抗孵育好后PBST洗3次，每次10min。9.显影准备好显影、定影两个盒子，装上显影液和定影液，配好显色剂（1:40），将膜放在暗盒里，蛋白面朝上，将显色剂滴在膜上，盖上透明膜，2min后压片。 10.stripping将膜放在stripping buffer 里，37度，3min。立即自来水洗干净.
数据统计分析 如无特殊提示, 所有实验结果均得自3 次独立实验, 数据采用x plusmn; s 表示。应用SPSS13.0 软件中的ANOVA 分析进行统计比较。
参考文献：
⑴张亚宏； 郭敬功； 郭子华； 谢松强。白藜芦醇通过激活p38-p53通路诱导人乳腺癌MCF-7 细胞凋亡。药学学报，2011年11期。
⑵徐菁。阿霉素载药胶束的制备及体外抗肿瘤活性研究。 ⑶张海江； 孙建华； 朱晓宇； 桑建利； 何大澄。p53对人乳腺癌细胞MCF-7生长及周期相关基因的影响。解剖学报2005年05期。
⑷于志勇； 左文述； 魏玲； 薛兴奎； 卓培英； 宋现让； 刘玉谭； 刘岩松； 周正波； 邵志敏。阿霉素对不同乳腺癌细胞株的抑制及凋亡调控作用。中国医学杂志 2005年01期。
资料编号：[385419]
文献综述 阿霉素是目前临床常用的蒽环类抗肿瘤药物，适用于急性白血病，恶性淋巴瘤、乳腺癌等。，可抑制RNA 和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。主要适用于急性白血病，对急性淋巴细胞白血病及粒细胞白血病均有效，一般作为第二线药物，即在首选药物耐药时可考虑应用此药。恶性淋巴瘤，可作为交替使用的首选药物。 P53基因 人体抑癌基因。该基因编码一种分子量为53kDa的蛋白质，命名为P53。p53基因的失活对肿瘤形成起重要作用。但是事物必然有它的两个方面，p53是一个重要的抗癌基因使癌细胞凋亡，从而防止癌变；还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。这种功能对于受化疗药物作用而受伤的癌细胞，则起修复作用，而不是使癌细胞自杀。造成被修复的癌细胞在治疗后成为新的肿瘤。抑癌基因p53的表达能够抑制人乳腺癌细胞MCF-7的生长,并可能通过阻抑cyclinD1和CDK2的表达而阻抑细胞周期S期进程,实现其调节功能。 实验方法 细胞培养 人乳腺癌MCF-7 细胞单层接种在含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培养液中, 在37 ℃、5% 二氧化碳培养箱中培养。 细胞生长抑制实验 取对数生长期的MCF-7 细胞, 以细胞数1.5times;104/孔接种于96 孔板。培养24 h后, 加入不同浓度的阿霉素; 或在加入不同浓度抑制剂1 h 后, 加入60 mu;mol·Lminus;1 阿霉素。每组设置3 个复孔, 同时设置阴性对照。置于培养箱中继续培养至不同时间点, 每孔加入5 g·Lminus;1 MTT 10 mu;L 再培养3 h 后, 吸弃上清液, 每孔加入DMSO 150 mu;L 溶解, 于酶标仪492 nm 处测定各孔吸收度 (A) 值。用MTT法检测抑制率,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡及凋亡相关分子根据公式计算抑制率: 抑制率 (%) = [A492(阴性) minus;A492(给药)] / [A492(阴性) minus; A492(空白)] times; 100% Hoechst 33258 荧光染色分析细胞凋亡时DNA的变化 取MCF-7 细胞, 以细胞数5times;105/孔接种于6孔板中。细胞爬片24 h 后, 加入60 mu;mol·Lminus;1 阿霉素作用48 h 后, 去培养液, 用PBS 洗1 遍。去PBS后, 用4%多聚甲醛固定1 h。去多聚甲醛后, 用PBS洗2 次, 加入终浓度为5 mg·Lminus;1 的Hoechst 33258 染色30 min, 封片。于荧光显微镜 (激发波长为350 nm,发射波长为460 nm) 下拍照。流式细胞仪分析细胞凋亡率[9] 取MCF-7 细胞,以细胞数1times;106/瓶分瓶, 培养24 h 后, 加入不同浓度的阿霉素; 或在加入不同抑制剂1 h 后, 加入60mu;mol·Lminus;1 阿霉素, 作用相应的时间。收集细胞, 用PBS 清洗1 次。70% 乙醇固定过夜, 次日将单细胞悬液离心弃去固定液, 用PBS 洗涤1～2 次, 加入50mg·Lminus;1 (0.1 g·Lminus;1 RNase A, PBS 配制) PI 染色液1.0mL, 置4 ℃避光染色1 h; 或根据Annexin V-FITC/PI染色试剂盒说明书操作后, 用流式细胞仪分析测定细胞内DNA 分布情况。 Western blotting 1.样品准备 ⑴提细胞蛋白（冰上操作）：a预冷的PBS洗3遍，将孔或培养瓶里的PBS吸干净；b加入蛋白裂解液，六孔板一个孔加200uL，培养瓶加400uL；c裂解5min；d细胞刮刀轻轻刮细胞，确保每个部位都刮到；e吸取上清到1.5mL EP管中；f裂解10min；g 12000转，离心10min；h上清转移到另一EP管中，-20度保存（若需长期保存（半月以上），则存于-80度冰箱）。⑵ 提组织蛋白（冰上操作）：a剪一小块组织（绿豆大小）于玻璃匀浆器中；b加500uL蛋白裂解液，匀浆；c转移匀浆液于1.5mL EP管中；d12000转，离心10min；e转移上清到另一EP管中；f通常组织蛋白的各样品浓度相差很大，定量结果不准确，这样western做出来的内参肯定不一致，所以调整蛋白至同一浓度（通常调整为2mg/mL），将蛋白液-20度或-80度保存 2.蛋白定量a配工作液，50:1配制；b做标曲，按下表加标准液；
