一、拟研究问题 本课题的研究内容是，构建PDI四个片段的重组大肠杆菌的质粒以及PDI片段蛋白的表达与纯化。
课题研究存在的难点：限制性内切酶酶切消化，需要注意酶切时间，以减少环状质粒残留，降低转化背景(假阳性克隆)。
另外还需要根据实验情况调整插入片段及线性化载体浓度，控制重组反应的温度和反应时间。
二、研究手段（一）表达PDI片段的大肠杆菌的质粒构建ClonExpress技术是一种简单、快速并且高效的DNA无缝克隆技术，可快速将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点。
同时使用SacI酶单酶切将PET-28a载体进行线性化。
利用引物设计软件CEDesign，自动生成a，b，b-x，a片段5和3，其最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列(15-20bp)。
这种两端带有载体末端一致序列的PCR产物和线性化载体按一定比例混合后，在重组酶的催化下，50℃反应5min可进行转化，完成同源重组。
菌落PCR鉴定为阳性的菌落，可再将剩余菌液接种至含有适当抗生素的LB液体培养基中培养过夜，提取质粒进行进行测序。
将测序成功的质粒pET-28a-a，pET-28a-b，pET-28a-a，pET-28a-b-x,用热激法转化到感受态大肠杆菌BL21细胞里面，通过加入IPTG诱导表达，表达产物使用镍柱亲和层析方法进行纯化，表达产物纯化后进行SDS-PAGE鉴定。
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