中国药科大学本科生毕业论文（设计）开题报告
课题名称：H1N1病毒聚合酶酸性PA蛋白的重组、表达及纯化
- 课题背景
H1N1是一种RNA病毒。它的宿主主要是犬类动物、鸟类和一部分哺乳动物。而经过鸟类和犬科动物的传播和变异，可能导致疫情或人类流感的大面积传播。根据记录，人类感染H1N1病毒曾在1976年和1988年出现造成两人死亡，而2013年12月，H1N1病毒扩散到美国十个州，引起4名儿童死亡，上万成年人入院治疗，严重危害人类安全。
H1N1的病毒结构是球形或丝状。在病毒基因组上包含8个单体RNA链代码为11个蛋白。总基因组大校是13588.分割性质基因组允许整个基因在不同的病毒载体的细胞同时存在。8个RNA的部分是：下编码血凝素的感染到宿主生物体HA、NA神经氨酸酶、NP核蛋白、M基质蛋白、NS的两种截然不同的非结构蛋白（NS1和NEP）、PARNA聚合酶、PB1的RNA聚合酶和PB2的RNA聚合酶。
PA、PB1、PB2作为H1N1病毒RNA聚合酶的三个亚基，在宿主体内翻译、表达之后与病毒RNA形成聚合酶-RNA复合体，参与病毒RNA的复制转录过程。其中PA已被证明具有蛋白酶活性，且有可能参与病毒RNA的复制。PA、PB1和PB2这三个亚基组成的聚合酶复合体是负责病毒基因组RNA复制以及病毒mRNA转录的主要组成和维持病毒生命周期至关重要的分子机器，同时由于它的高度保守性、低突变率、流感病毒RNA聚合酶已经成为了抗流感病毒药物设计潜在的重要靶点。近年来的研究认为：PB1是病毒RNA聚合酶的催化亚基，负责病毒RNA的复制及转录；PB2负责以一种成为Snatch的方式夺取宿主mRNA的CAP帽子结构用于病毒mRNA转录。而相对于其他两种亚基来说，PA是了解最不清楚的蛋白。根据已有的大量报道，PA亚基被发现不但参与病毒复制过程，而且还参与病毒RNA转录、内切核酸活性、蛋白酶活性以及参与病毒粒子组装等多种病毒活动过程，但是其参与这些活性的分子机制并不清楚，因而在整个聚合酶复合体的研究中显得格外重要和突出。蛋白质结构的解析对揭示蛋白质功能具有重大作用。但是，长期以来由于种种困难的存在，该蛋白的结构一直未能够获得解析。
本次实验中，我们将会构建带有HIS标签的重组PA蛋白，然后利用原核表达系统 E.coli表达这个蛋白。
His标签是现在高通量蛋白纯化使用最普遍的亲和标签，被广泛使用于多种重组蛋白在各种表达系统的表达与纯化中。His 标签一般 5-15个组氨酸，在通常情况下被认为是重组蛋白纯化的首选标签，它有下列几个优点：（1）位于目标蛋白N端的His标签与细菌的转录翻译机制相互兼容，有利于蛋白的表达；（2）His标签几乎不影响目标蛋白的理化性质；（3）His标签比较小，一般情况下不改变目标蛋白的可溶性；（4）His标签在目标蛋白结晶后对蛋白结构几乎不造成影响；（5）采用固定化金属离子亲和层析纯化His标签融合蛋白时，它的操作比较简便。基于上述的几个优点，几乎所有的大型结构基因组研究中心都把纯化His标签融合蛋白的固定化金属离子亲和层析作为主要的蛋白纯化方法。
His标签融合蛋白一般采用固定化金属离子亲和层析来进行纯化分离。固定化金属离子亲和层析又被称为金属整合层析，是在20世纪中期发展起来的一种新型分离技术。它根据蛋白表面的一些氨基酸，如组氨酸半胱氨酸，色氨酸等，与金属离子发生相互作用，从而对蛋白质加以分离。这些作用包括以配位键结合为主，配合共价键结合，静电吸附等作用。由于他具有配体简单，吸附量较大，通用性较强，纯化条件温和，上样条件可选择范围广等特点，固定化金属离子亲和层析已经称为目前分离纯化重组蛋白最有效的技术之一。
原核表达的重组蛋白经过Ni金属螯合亲和层析，纯化该标签蛋白，再利用离子交换层析，凝胶分子筛层析的方法进一步纯化，最终得到高纯度的PA蛋白。为后续得到蛋白晶体，解析H1N1病毒RNA聚合酶三维结构并进一步认识该病毒的生物功能奠定了基础。
