- 文献综述（课题背景）
总胆汁酸(TBA)是人胆汁中的主要成分，是胆固醇在肝脏分解代谢的产物，是由肝脏分泌到胆汁中，并随胆汁排入肠腔，作用于脂肪的消化吸收，同时可维持胆汁中胆固醇的可溶性状态，以防止胆固醇性胆石的形成。总胆汁酸在肠腔经细菌作用后，95%以上的胆汁酸被肠壁吸收经门静脉血重返肝脏利用，称为胆汁酸肠—肝循环。故正常人血中胆汁酸浓度很低。胆汁酸的生成和代谢与肝脏有十分密切的关系。[1] 当肝细胞受损害时，不能有效地摄取从肠道回吸收的胆汁酸，血中胆汁酸浓度升高；胆汁淤积时，肝细胞分泌胆汁功能障碍，不能很好地排出胆汁酸，所以血中胆汁酸也会升高。急性肝炎时患者血清TBA与丙氨酸转氨基酶(ALT)一样，呈显著增高，平均增高幅度是正常的31倍，说明TBA对急性肝炎早期诊断价值与ALT测定相同，经积极治疗后随肝细胞损害的控制很快转为正常，而TBA则随肝功能的恢复逐渐转为正常。慢性肝炎时，TBA阳性率为65.7%，平均升高幅度为正常的10倍。[2] 有人认为，在慢性肝病如肝硬化，胆汁酸升高的出现比白蛋白，胆固醇，胆固醇酯，胆红素的改变来得更早，因此对慢性肝病的诊断有重要意义。[3] 而总胆汁酸的主要成分是胆酸。胆酸分子是一水合物，常温下为白色片状结晶。最早是由德国科学家海因里希·奥托·维兰德发现并对其结构进行测定，并在1927年荣获诺贝尔化学奖。研究胆酸检测技术对于肝炎疾病的临床诊断具有重大意义。
我们建立的检测胆酸分子的实验实际上属于体外检测。对于体外检测（IVDs），它在临床治疗方面，是一个不可或缺的重要组成部分，它可以对从活体的样品，如血液，尿液，和组织进行诊断测试。这样的试验通常是检查或者确定个体中现有的疾病。IVD测试由于在医疗行业具有特色鲜明特点从而备受公众关注。第一，IVD测试不直接与人体相互作用，可以不用微创手术进行诊断，从而减少了大量的痛苦。第二，体外诊断是对于样品进行的而不是人体，它避免了体外诊断的患者产生可能的生物安全性的问题。第三、IVD测试可以快速提供病人医疗状况的有价值的信息。第四、体外诊断的应用使早期诊断和治疗严重的疾病更加容易。一般来说，早期测试的成本远低于后来广泛的治疗。最后，IVDs发挥特别重要的作用在为急性传染病疫情管理的远程设置，它的简单而有效的诊断系统是非常实用可取的。这些特点使IVDs在医疗技术方面显得重要与独一。[5]
与普通的体外检测技术相比，用金纳米改进的功能后的IVDs大大推动了高度敏感和便捷传感器的发展。由于纳米技术的发展，使用纳米材料[11]对IVDs的设计已经有了巨大的进步。纳米材料的设计使它具有独特的物理化学性质以及理想的化学和生物检测特性，这些特性表现在大的面积体积比，强烈的信号强度，以及精细谐调的表面化学性质等方面。[6] 详细地来讲，由于其大的表面积比，纳米材料可以加载多种信号转导（如酶、DNA和有机染料），允许检测超低浓度的分析物。而且，多功能化纳米材料可以通过化学方法进行多参数分析同时实现实时和多个目标的直接检测。不仅如此，金纳米可调节的化学表面赋予纳米材料许多丰富的特性，它增强了分析性能，尤其是对于小型分析物的检测。[7，a] 到目前为止，基于各种纳米科学的研究很多，如碳纳米管、[7，b]硅纳米线、[7，c]量子点[7，d]、磁性纳米粒子[8]和纳米金。[9] 而这些只是其中的一部分。它们旨在为生物标记物的高灵敏度的IVD系统的创建。这些系统可以检测生物标记物在、pico-,femto-,atto-甚至zepto-级别摩尔浓度。高敏感度将开启一个早期诊断和治疗疾病新时代。金纳米粒子为基础的IVDs,同时引起了极大的研究兴趣,这是由于其独特的物理和光学性质，包括局域表面等离子体共振（LSPR）、荧光共振能量转移（FRET），表面增强拉曼散射（SERS），非线性光学性质，和量化的充电效果。总结来说，金纳米具有很多优点。首先，纳米金的合成可以在寻常化学实验室很容易可重复地实现。[10] 第二，金纳米粒子的表面修饰通常是基于金minus;硫键的形成，它具有高度稳定的性质，并且提供多样化的功能化选择。[11] 第三，金纳米粒子的大小，形状，聚集状态，以及表面性质可以微调，这在化学和生物传感器方面是非常重要的。最后，金纳米粒子的生物安全性被认为是优于许多其他纳米材料的。当选择合适的尺寸和表面涂层的时候，它提供优异的生物相容性。
我们实验在基于金纳米的基础上，同时利用核酸适配体修饰对于胆酸进行体外检测。核酸适配体（Aptamer）是一段DNA（脱氧核糖核酸），RNA（核糖核酸）序列，XNA（核酸类似物）或者肽。一般是利用体外筛选等技术从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。[4]核酸适配体是最近几年来出现的一种类似抗体的能够和靶分子特异结合的识别分子，[12,13] 与抗体相比具有靶分子范围广、可体外制备、性能稳定、标记便捷和开发多种检测方法等许多优点。 基于适配体的特性，近年来开发了比色、[14,15] 电化学、[16,17] 化学发光、[18] 荧光[19]等检测方法。纳米金作为一种制备简 单、便于吸附生物分子的纳米材料,具有极高的消光系数 (较普通有机染料高大约3个数量级)和强的粒子间距光学效应,它在分散状态下呈现红色,发生凝聚后转变成蓝色,反之也可以由蓝色变成红色。[20] 因此纳米金比色法的灵敏度可以达到荧光法相同的灵敏度。[21,22]
我们了解到，传统的胆酸检测方法主要借助 HPLC 或 GC - MS 等分析仪器,可以准确灵敏地检出样品中的胆酸,但该方法分析时间长,操作复杂,需要大型精密仪器, 成本高、结果无法可视化。而本文是基于适配体修饰的金纳米颗粒的检测方法。具体的实验机制，我们查阅了大量文献，发现单链DNA（ssDNA）吸附在枸橼酸盐涂层的金纳米球，这是依赖于它的基因序列的方式。[23]相比于脱氧核苷dT，脱氧核苷dA，dC，和dG对于金表面有更高的结合亲和力。[28]然而，不同的DNA序列，在晶体生长过程中对金纳米颗粒形貌的影响还没有被研究。为了研究这个因素，我们选择了三种30个碱基的DNA组成的多聚A，C和T（命名为A30，C30，和T30）和20 nm的柠檬酸盐涂层AuNSs作为种子用于纳米颗粒的生长。此外，羟胺（NH2OH）能用于对氯金酸在金的表面催化的还原（III）（HAuCl4）[29]从而作为本实验的还原剂。在一个典型的合成，将AuNSs（0.5 nm）首先与DNA（1mu;m）孵育15分钟以允许DNA在AuNS的吸收，再加入20mM NH2OH，以及氯金酸（167mu;M），并且快速涡旋他们混合以方便还原。令人惊讶的是，纳米颗粒的合成溶液中，A30和C30是以蓝色存在的，而合成纳米粒子T30是红色。所得到的最终溶液数天都稳定并且没有显示任何纳米粒子聚集或颜色变化。Rothberg[24]最先发现单链DNA可以直接吸附到纳米金表面,并保护纳米金溶胶免于高盐浓度(200nmol·L-1)引起的凝聚变蓝。也就是说，核酸适配体能够通过金-核酸亲和力以及镁离子的电荷屏蔽作用吸附在金纳米颗粒表面，形成适配体功能化的金纳米探针。当待测液中含有胆汁酸分子时，金纳米表面吸附的适配体能与胆汁酸分子特异性结合，适配体的构象发生改变，随后从金纳米表面解吸下来，使金纳米探针表面的适配体量逐渐减少。然后向金纳米探针溶液中加入盐酸羟胺和氯金酸，使金纳米颗粒再生长，当金纳米颗粒表面吸附的适配体量较少时，金纳米呈球形生长，溶液为红色；反之，吸附的适配体量较多时，金纳米呈花形生长，溶液为蓝色。同时，随着适配体的量逐渐增大，再生长后的金纳米的LSPR峰逐渐红移。以再生长的金纳米溶液的颜色、金纳米颗粒的形貌及LSPR峰反应胆汁酸浓度，构建基于金纳米的胆汁酸检测探针。基于这样的原理，建立了胆酸分子的检测方法。由于适配体纳米金比色技术具有简单、快速、灵敏、结果肉眼可见、便于现场使用等优点,因此本实验建立的适配体修饰的金纳米颗粒的胆酸检测具有良好特性并具有重大意义。[25，26，27]
二、研究方案
（一）研究目标
制备适配体功能化的金纳米探针，建立金纳米比色法检测胆酸分子的方法，并将其用于胆酸溶液的检测。
（二）研究内容
（1）金纳米颗粒的制备和表征
