灰树花液体菌种培养基的优化及多糖含量的测定文献综述

 2022-12-10 15:03:10
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开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

目的意义：

灰树花（Griofola frondosa（Fr.）S.F.Gray）又名贝叶多孔菌，俗称栗子蘑、莲花菇、舞茸等，在分类系统中属于担子菌亚门、层菌纲、非褶菌目、多孔菌科Polyporaccae、树花属Grifola。[1]灰树花是一种珍稀的食、药两用菌，富含有多糖、氨基酸、多种维生素、微量元素与生物活性物质，其中多糖是存在于灰树花菌丝体中的主要有效组分之一，具有很明显的抗肿瘤，抗 HIV 病毒，治疗肝炎，对免疫系统功能紊乱都有很好的疗效，且无任何毒副作用，是一种较好的保健食品和新型医药原料。[2]但目前工厂化栽培灰树花主要以固体菌种作为生产用种，存在栽培周期长、菇房利用率低，经济效益低下等问题。因此灰树花液体菌种的开发和应用，可以较大程度的缩短生产周期，减少低污染率，降低成本，提高效益，且菌丝发酵生产也是灰树花多糖生产的重要途径。碳、氮源、初始PH、豆油和磷酸二氢钾的用量均会影响菌丝生长及多糖的产生，其中碳、氮源分别是影响菌丝生长和多糖形成的主要因素，因而只有合适的碳氮比才能利于灰树花的生长。[3]研究发现灰树花对碳源的利用相当广泛，对单糖、双糖、多糖均可利用，其中葡萄糖更有利于灰树花菌丝体的生长。灰树花对有机氮的利用强于无机氮。有机氮以天然农副产品中的麦麸为最好；在无机氮中，灰树花对铵态氮的利用略强于对硝态氮的利用。灰树花液体发酵培养最适的PH值为6.0，接种量为10%。灰树花菌丝体在中等装液量下，生物产量最多。25℃,150～180 r/min振荡培养144h即可结束发酵,其发酵周期较短,便于大规模工业生产[4]

本课题以菌丝体量和灰树花多糖为指标，通过对碳、氮源多因子多水平的对比试验，对灰树花液体菌种培养基进行优化，寻找一个菌体量大、多糖含量高的最优培养基配方，并探索最佳发酵工艺条件。

方案设计：

灰树花保藏菌种--斜面扩大培养--摇瓶培养--液体菌种培养--碳源选择－氮源选择--碳、氮正交实验－最适液体培养基配方确定--发酵工艺条件探索

1.斜面培养：培养温度25℃

PDA培养基，土豆20%,葡萄糖2%,琼脂2%,加水至所需体积，pH5～6

基础培养基:

葡萄糖3%，蛋白胨0. 2%，酵母膏0. 5%，KH2PO4 0. 15%，MgSO4 0. 05%,VB1 0.002%

摇瓶发酵培养：温度28℃,起始pH值6. 0,接种量10%,装液量为100mL /500mL三角瓶。

碳、氮源实验：把灰树花菌丝斜面菌种转入液体培养基进行碳、氮源试验。依次以葡萄糖、玉米粉、淀粉、蔗糖、麦芽糖、乳糖、麸皮作为碳源,依次以蛋白胨、酵母膏、豆饼粉、玉米粉、硫酸铵、硝酸铵作为氮源，28℃摇床培养，[5]培养结束后，取发酵液离心洗涤后分别测其菌体干重和菌体胞内多糖含量，确定最适碳、氮源。

接着进行正交试验。最终确定最佳培养基配方。

2. 菌丝体干重测定

取发酵液经纱布过滤，收集沉淀的菌丝60℃烘干，称重。

3.灰树花多糖提取与含量测定：

精密称取干燥灰树花菌丝粉--加入蒸馏水--搅拌均匀--调 pH--超声提取--过滤--真空浓缩至 原体积的三分之一--醇沉--离心--真空冷冻干燥--水溶性粗多糖%

标准曲线的制备

葡萄糖标准品--加水溶解后定容--制成1mg/ml标准葡萄糖溶液--精密吸取1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml于25ml容量瓶--定容--各取2ml加苯酚1ml，硫酸5ml摇匀--室温显色30分钟--以水同上操作，作为空白--490nm测吸光度--以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘标准曲线--取定容至50ml的提取液2ml--加苯酚1ml,硫酸5ml,室温放置30分钟--以水为空白，同上操作--490nm测吸光度--根据标准曲线求出浓度，计算多糖含量

多糖含量（%）=浓度（mg/ml）*50/(重量*1000)*100%[6]

1.碳源的选择

以3%玉米粉、淀粉、蔗糖、麦芽糖、乳糖、麸皮为供试碳源，葡萄糖为对照。

培养基

菌丝体量（5d）

多糖含量

（5d)

葡萄糖3%，蛋白胨0. 2%,酵母膏0. 5%,KH2PO40. 15%,MgSO40. 05%,VB1 0.002%（对照）

玉米粉3%，蛋白胨0. 2%,酵母膏0. 5%,KH2PO40. 15%,MgSO40. 05%，VB1 0.002%

淀粉3%，蛋白胨0. 2%,酵母膏0. 5%,KH2PO40. 15%,MgSO40. 05%，VB1 0.002%

蔗糖3%，蛋白胨0. 2%,酵母膏0. 5%,KH2PO40. 15%,MgSO40. 05%，VB1 0.002%

麦芽糖3%，蛋白胨0. 2%,酵母膏0. 5%,KH2PO40. 15%,MgSO40. 05%，VB1 0.002%

乳糖3%，蛋白胨0. 2%,酵母膏0. 5%,KH2PO40. 15%,MgSO40. 05%，VB1 0.002%

麸皮3%，蛋白胨0. 2%,酵母膏0. 5%,KH2PO40. 15%,MgSO40. 05%，VB1 0.002%

2.氮源的选择

以1%酵母膏、豆饼粉、玉米粉、硝酸铵、硫酸铵为供试氮源，蛋白胨为对照。

培养基

菌丝体量

(5d)

多糖含量

(5d)

1%蛋白胨，葡萄糖3%， KH2PO4 0. 15%，MgSO4 0. 05%，VB1 0.002%（对照）

1%酵母膏，葡萄糖3%， KH2PO4 0. 15%，MgSO4 0. 05%，VB1 0.002%

1%豆饼粉，葡萄糖3%， KH2PO4 0. 15%，MgSO4 0. 05%，VB1 0.002%

1%牛肉膏，葡萄糖3%， KH2PO4 0. 15%，MgSO4 0. 05%，VB1 0.002%

1%硝酸铵，葡萄糖3%， KH2PO4 0. 15%，MgSO4 0. 05%，VB1 0.002%

1%硫酸铵，葡萄糖3%， KH2PO4 0. 15%，MgSO4 0. 05%，VB1 0.002%

3.正交试验

由实验一筛选出最佳碳、氮源，同硫酸镁，磷酸二氢钾，进行正交因素水平实验。

水平

碳源

氮源

KH2PO4

MgSO4

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3

按以下正交试验表进行试验，pH5.0-6.0，培养基灭菌后，接入液体母种菌丝，25℃摇床培育7天。比较菌丝体干重及多糖含量。

试验号

碳源A

氮源B

KH2PO4 C

MgSO4 D

菌丝体干重g/100ml

多糖含量

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1

1

1

2

2

2

3

3

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3

1

2

3

2

3

1

3

1

2

1

2

3

3

1

2

2

3

1

K1

K2

K3 k1=K1/3

k2=K2/3

k3=K3/3

R

优水平

结果分析和讨论：

针对实验结果，进行分析比较，得出灰树花液体菌种的最优培养基配方。对优选出的培养基进行接种量、温度、转速等发酵培养条件进行对比，探索发酵工艺。

进度安排：

3月10号～3月13号 PDA培养基的配置以及材料准备

3月16号～3月27号 斜面培养

3月30号～4月14号 碳源筛选试验

4月15号～4月28号 氮源筛选试验

4月29号～5月15号 正交试验

5月18号～5月30号 对实验结果进行分析、讨论并撰写论文

参考文献：

  1. 灰树花液体发酵的环境条件优化研究，卜庆梅，王淑芳，董洪新，黄清荣，来广生，湖北农业科学，2005，No.3 uarr;

  2. 灰树花液体培养基配方的研究，马忠友，刘乐，吴萍，王松华，邓盾，安徽科技学院学报，2011,25（3） uarr;

  3. 灰树花液体培养基配方的研究，马忠友，刘乐，吴萍，王松华，邓盾，安徽科技学院学报，2011,25（3） uarr;

  4. 灰树花液体发酵的环境条件优化研究，卜庆梅，王淑芳，董洪新，黄清荣，来广生，灰树花液体发酵的环境条件优化研究，2005，NO.3 uarr;

  5. 灰树花液体培养基的筛选试验，肖春玲，邓贤兰，食用菌，2004（1） uarr;

  6. 超声波-微波协同提取灰树花多糖工艺研究，姜笑寒，徐清，邱建波，刘红梅，制剂与技术，2011，2,18（6） uarr;

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