开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
酪蛋白作为乳中含量最高的蛋白质[1-2]，在治疗龋齿，防治骨质疏松与佝偻病，促进动物体外受精，调节血压，治疗缺铁性贫血、缺镁性神经炎等多种生理功效，尤其是其促进常量元素（Ca、Mg）与微量元素（Fe、Zn、Cu、Cr、Ni、Co、Mn、Se）高效吸收的功能特性使其具有“矿物质载体”的美誉。它可以和金属离子，特别是钙离子结合形成可溶性复合物，一方面有效避免了钙在小肠中性或微碱性环境中形成沉淀，另一方面还可在没有VD参与的条件下使钙被肠壁细胞吸收，因此被认为是最有效的促钙吸收因子之一，它的发现为补钙制品的研发提供了一种新方法。酪蛋白可通过机体内消化或体外酶解的方式可以释放出高活性的肽段，现已被公认为是国内外研究最多、最深入，应用领域极为广泛，且极具开发价值的一类分子结构与生物功能间有明确对应关系的活性物质。大量研究表明，酪蛋白的性质与其分子量的大小密切相关，但药典中尚无关于蛋白类物质分子量检测标准的报道，因此，建立蛋白类物质分子量的检测方法已成为现在研究的热点。
当今蛋白质分子量测定方法主要包括三类[3]：SDS-PAGE 凝胶电泳检测、质谱法检测以及凝胶渗透色谱法检测。聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的原理为SDS是一种阴离子去污剂[4-6]，可使蛋白质变性，与其蛋白质结合成带负电荷的蛋白质-SDS复合体，消除电泳过程中蛋白质所带电荷对电泳结果的影响，从而保证蛋白质电泳仅受分子质量大小的影响。在一定的电场作用下，该复合体沿着以聚丙烯酰胺凝胶形成的分子筛向电场的正极移动，从而将蛋白质根据他们的分子量大小而分开。其成本低，分辨率高，重复效果好，但是对于电荷异常或者构象异常的蛋白、带有较大辅基的蛋白及一些结构蛋白测定的分子质量不太可靠，而且电泳结束后还需要染色，染色，脱色比较耗时。
质谱法以电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）和基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-MS）应用较为广泛[7-9]。电喷雾离子化质谱技术（ESI-MS）是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷密度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相的质谱技术。ESI-MS测定蛋白质大分子是根据一簇多电荷的质谱峰群，通过解卷积的方式计算得到蛋白质的分子量，由于ESI-MS可以产生多电荷峰，因此使得测试的分子质量范围大大扩大。该法的优点在于对样品分子质量测试灵敏度、分辨力和准确度都相当高，但是同样对样品纯度要求高，且会形成多电荷的质谱峰群，难以分辨，使得结果分析较为困难。基质辅助激光解吸电离质谱技术（MALDI-MS）是将待测物悬浮或溶解在一个基体中，基体与待测物形成混晶，当基体吸收激光的能量后，均匀传递给待测物，使待测物瞬间气化并离子化。将它与经典的脉冲化工作方式的飞行时间质谱仪（TOF）直接联用，即我们常听到的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比，检测离子。其优点在于MALDI-MS 的最高分辨率不断提高，甚至超过ESI-MS，但是在与高效液相色谱、毛细管电泳等分离设备的联用时，目前只能采取离线的方式，致使分析结果的重复性较差，与MALDI-MS 本身高精密度的特性不匹配。
除了以上几种目前常用的测定方法，还有一些现在在实验室一般不太使用的方法，包括粘度法，渗透压法，辐射失活法，超速离心沉降法，光散射法等[10-11]。
因此，选择周期短，易分析、结果稳定的检测方法就显得尤为重要。凝胶渗透色谱（GPC）又称凝胶排阻色谱（SEC）[12-14]，当生物大分子通过装有凝胶颗粒的层析柱时，根据它们分子大小不同而进行分离。凝胶层析的固定相是惰性的柱状凝胶颗粒，颗粒内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。不同分子大小组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子的大小。对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面，具有高效、高速、高灵敏度的特点。此法操作简单，检测时间短，结果易于分析且条件温和，一般不引起生物活性的改变，更适合选择针对蛋白质分子量检测条件进行探究，以得到更加准确的分子量结果。
综上所述，本课题利用凝胶渗透色谱法（GPC）对酪蛋白分子量进行测定，旨在探究最佳色谱检测条件，得到较为准确的酪蛋白相对分子质量分布，为以后酪蛋白相对分子质量测定标准提供参考方法，也为今后实践中生产较好品质的酪蛋白提供了理论依据。
参考文献：
[1]李晓晖. 牛乳中酪蛋白的结构特性及其应用[J]. 食品工业, 2002(1):29-31.
[2]王维君, 佟永薇, 石红. 酪蛋白生物活性肽的特性及应用前景[J]. 食品研究与开发, 2010, 31(8):211-214.
