一、研究背景amp;研究意义
多发性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）是浆细胞恶性增殖性疾病，患者骨髓中的浆细胞像肿瘤细胞一样无限制地增生，并且大部分病例伴有单克隆免疫球蛋白分泌，最终导致器官或组织损伤，是血液系统的第二大恶性肿瘤。研究表明，在许多恶性肿瘤疾病中，都发现有蛋白酶体活性的异常改变。真核细胞内蛋白质的降解途径主要有两条：一是溶酶体途径，主要降解膜蛋白和长寿命的蛋白质等;二是泛素蛋白酶体途径( Ubiquitin-proteasome system，UPS)，此系统介导了细胞内80％以上蛋白质的降解，包括异常蛋白质和短寿命的蛋白质等。因此，在临床应用方面，蛋白酶体抑制剂成为抗肿瘤治疗的重要手段之一。目前临床常用化疗方案组合为：蛋白酶体抑制剂/免疫调节剂 糖皮质激素或蛋白酶体抑制剂/免疫调节剂 传统化疗药物 糖皮质激素。经证实，含有蛋白酶体抑制剂/免疫调节剂新药的方案的疗效明显优于传统化疗方案。故MM患者应尽量采用包含蛋白酶体抑制剂/免疫调节剂新药的方案治疗。虽然蛋白酶体抑制剂及免疫调节剂在临床上取得了一定疗效，但是由于复发、耐药的出现以及它的毒副作用，如周围神经病变，血小板低下，胃肠道刺激，乏力以及抑制造血系统、免疫系统等，使得其应用受到了限制[1]。由于蛋白酶体存在于机体的各类细胞中，非选择性的蛋白酶体抑制剂对体内细胞的蛋白酶体功能均有一定程度的抑制效应，由此对机体产生严重的毒副作用。
有研究表明，藤黄酸是一种组织特异性钙蛋白酶抑制剂，它可以通过特异性抑制靶向泛素特异性蛋白酶2a（ubiquitin-specific proteasome 2a,USP2a）从而抑制肿瘤细胞的增殖以及诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡[2-3]。并且有研究表明在有效剂量范围内，藤黄酸对于实验动物的造血功能以及免疫功能没有明显的影响[4]。因此，藤黄酸可发展为一种理想的治疗多发性骨髓瘤的药物。
在我们的前期研究中，我们发现钙蛋白酶2可能是藤黄酸的作用靶点，也已经证实藤黄酸与钙蛋白酶2有较强的结合能力。钙蛋白酶是一种细胞内的钙离子依赖性蛋白酶，广泛地表达在高等动物的细胞质中，并且在细胞内各种钙离子调控的生物功能中发挥重要作用[5]。人体内主要有两种钙蛋白酶，mu;-钙蛋白酶和m-钙蛋白酶，它们在动物组织中无处不在，并且可以纯化为由一个较大的不同的催化亚基80K和一个较小的常见调节行亚基30K组成的异二聚体[6]。查阅文献时，我们发现钙蛋白酶在大肠杆菌表达系统以及真核细胞表达系统中均有较好的表达结果。但是前期我们利用大肠杆菌表达系统来表达钙蛋白酶2，效果并不理想，本研究将采用真核细胞表达系统来表达人钙蛋白酶2，并且纯化后采用共晶的方法得到并阐释藤黄酸与钙蛋白酶2的结合作用模式。
二、课题研究内容
1、构建用于表达人CAPN2蛋白的质粒：通过PCR、酶切酶连等方法，将人CAPN2基因构建到pcDNA3.1( )载体中，并带有His标签；
2、将pcDNA3.1( )-CAPN2转染进真核细胞293f，进行培养；
3、收集细胞，纯化CAPN2蛋白：通过亲和层析和分子筛得到纯度较高的CAPN2蛋白；
4、将CAPN2蛋白与小分子藤黄酸进行共晶：筛选优化结晶条件，得到共晶，并解析其结构。[6-9]
参考文献
