一、实验背景
热休克蛋白90（Heat shock protein 90, Hsp90）是一种三磷酸腺苷（adenosine 5′-triphosphate, ATP）依赖性蛋白分子伴侣，其主要功能为协助蛋白的正确折叠过程，并维持体内蛋白平衡。[1]。研究表明，Hsp90作为分子伴侣深度参与蛋白循环与激酶水平调控，诸多Hsp90下游客户蛋白在多种肿瘤细胞的生长和增殖中起到了十分重要的作用，与肿瘤发生发展的高度相关性使Hsp90成为了重要的的抗肿瘤靶标[2, 3]。现有靶向Hsp90的主要策略是竞争性抑制Hsp90 N端结构域上的三磷酸腺苷酶（adenosine triphosphatase, ATPase）结合位点。截至目前，针对此位点已有17种不同结构类型的小分子抑制剂进入了临床试验阶段。然而，现有Hsp90抑制剂临床上表现出多种毒性（如心脏毒性，胃肠道毒性和眼毒性等），临床试验过程中有效性有限且不可避免地引起热休克反应，因此难以获批上市[4, 5]。上述毒性和热休克反应的原因可能是该类Hsp90 N端抑制剂与ATPase口袋的直接结合阻止ATP水解，进而不可避免地影响到Hsp90的所有客户蛋白，干扰机体正常的生理学进程[5]。因此，直接靶向Hsp90 ATPase结合位点完全抑制Hsp90全部功能并不是最为理想的Hsp90调控方式，而通过其他位点特异性地调控Hsp90来引入全新的靶向策略具有极高的研究价值。
Hsp90分子伴侣循环是一个包括多种辅分子伴侣之间蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interactions, PPIs）的动态过程。定量分析Hsp90与其辅分子伴侣相互作用揭示了其底物识别的特异性[6]。Hsp70、Hsp40、Cdc37等不同的辅分子伴侣通过与Hsp90的直接PPI实现不同的功能和选择性。其中，作为Hsp90蛋白分子伴侣循环的辅分子伴侣Cdc37，可选择性识别游离的未折叠激酶类客户蛋白，负责将包含受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶和细胞内丝氨酸/苏氨酸激酶在内的多种激酶募集至二聚化的Hsp90，在二聚化Hsp90与ATP结合完全闭合后完成激酶正确折叠[7]。研究显示，前列腺癌肿瘤细胞都具有Cdc37高表达的特征，Hsp90-Cdc37-激酶复合物的形成促进了激酶整合到Hsp90分子伴侣机器中而最终成熟[8, 9]。L. Stepanova等人的研究显示，Hsp90-Cdc37协同促进多种过表达或突变的致癌蛋白的正确折叠，最终加速了肿瘤的发生[8]。
Cdc37结构分为包括关键磷酸化丝氨酸残基（S13）的N末端客户激酶结合结构域、与Hsp90结合的M端中央结构域和一个功能未知的C端结构域。迄今已有两种不同的Hsp90-Cdc37的共晶结构部分揭示了Hsp90-Cdc37对激酶识别募集和折叠机制的动态循环[9, 10]。尽管进行了一些探究Hsp90-Cdc37中的重要残基的突变研究，但整个动态过程中负责Hsp90与Cdc37之间精确识别的相互作用和潜在的小分子结合位点仍未被发现[11, 12]。由于Hsp90与Cdc37之间蛋白-蛋白相互作用的表面结合模式没有深的结合口袋和明确的作用位点，因此寻找与Hsp90-Cdc37关键残基作用的小分子具有相当的挑战性。
Hsp90在正常细胞和恶性细胞中的表达水平没有显著差别，而Cdc37过表达上调大量激酶导致恶性肿瘤的发生发展 [13]。由于Cdc37在增生组织中发生特异性表达上调且在多种肿瘤中明确高表达，而大多数正常组织维持正常生理机能却不需要Cdc37，因此在不损害Hsp90 ATPase活性的情况下抑制Hsp90-Cdc37 PPI可能会获得与直接抑制Hsp90完全不同的治疗效果[14]。我们在上述机制的基础上，特异性识别关键残基并选择性破坏Hsp90与Cdc37之间的相互作用有望精确阻断激酶客户蛋白的正确折叠，实现抗癌治疗效果。
二、实验目的和意义
如上所述，当前的Hsp90抑制剂大多数通过竞争性抑制ATPase结合位点发挥抗肿瘤活性，而由此产生的热休克反应和高毒性限制了这些抑制剂的临床进展，可见直接靶向Hsp90 ATPase结合位点以完全抑制Hsp90并不是最为理想的方式。特异性调控Hsp90伴侣需要关注并全面了解整个分子伴侣系统Hsp90调控过程。在该过程中，不同辅分子伴侣与多伴侣Hsp90复合物之间多样化的PPI发挥着关键作用[15]。其中，Hsp90-Cdc37相互作用功能机制明确且具备充足的结构生物学数据。基于Hsp90-Cdc37 PPI相互作用识别模式合理设计的新型小分子调控剂有望在发挥Hsp90抗肿瘤活性的同时避免因直接抑制Hsp90的ATP酶活性而产生的热休克反应与Hsp90下游客户蛋白的普遍抑制。
Hsp90-Cdc37复合物作为理想的靶标，有如下优势：
- Cdc37在肿瘤细胞中的表达明显多于正常细胞，提供细胞层面的潜在的良好选择性[16]；
- Cdc37是Hsp90的一种激酶特异性辅分子伴侣，破坏Hsp90与Cdc37之间的相互作用或直接抑制Cdc37可以实现Hsp90激酶客户蛋白的靶向抑制；
- Cdc37通过某些基序或特异性结合位点与Hsp90相互作用而不会影响其他辅分子伴侣的结合，表明分子水平的潜在特异性调节机制能提供更好的安全性。 因此，靶向Hsp90-Cdc37 PPI的小分子的发现可以替代现有的对于Hsp90的低效调控方式，避免高毒性并且充分发挥Hsp90的抗癌潜力。
目前，仅有少数几种天然产物能够通过Hsp90-Cdc37抑制机制表现出抗癌活性，而尚无小分子与Hsp90或Cdc37特异性结合通过阻断关键识别残基在细胞水平破坏Hsp90-Cdc37相互作用以抑制肿瘤[17-20]。尽管DCZ3112和许多其他天然产物（例如celastrol）可以在细胞水平上抑制Hsp90-Cdc37 PPI，但准确结合位点和调节机制尚不明晰[17, 19] 。由于Hsp90-Cdc37 PPI的结合表面较大且过程动态，研究特定Hsp90-Cdc37 PPI抑制剂面临的最大挑战是小分子准确结合位点的不确定性。
总而言之，我们的实验目的在于通过特定的小分子探究Hsp90-Cdc37相互作用识别模式，从而为肿瘤治疗中Hsp90与Cdc37或其他伴侣分子之间相互作用的调节提供研究基础。
