【研究目的】
射干Belamcanda chinensis( L.) DC.是鸢尾科射干属的多年生草本植物，药用部位为干燥的根茎。现代研究表明射干含有丰富的黄酮类成分，具有明显的抗炎及抗病毒活性，近年来临床用于治疗流感及上呼吸道感染，效果很好，因此利用细胞培养技术生产黄酮类成分是一条有效途径。
添加真菌诱导子是常用的一种提高细胞培养中次生代谢产物积累的方法，本项目拟从射干健康的叶、根茎中分离出的内生真菌制备成诱导子，研究利用真菌诱导子来诱导射干细胞中关键基因的表达，其与射干悬浮细胞系相互作用机制，为诱导子作用于射干悬浮细胞进行黄酮类成分的生产提供理论指导。
【文献综述】
化合物在生物体内的一系列代谢过程可分为初生代谢(primarymetabolism)和次生代谢(secondarymetabolism)。其中,初生代谢合成生物体生存所必需的化合物,如糖类、脂肪酸类和核酸类的代谢。有些生物体利用某些初生代谢产物为原料,在一系列酶的催化下,形成一些特殊的化学物质的过程,称为次生代谢,这些特殊的化学物质即为次生代谢产物(secondary metabolite),如生物碱、黄酮体、萜类、有机酸、木质素等。植物的次生代谢在保护机体不受食草生物、哺乳动物和微生物的侵害,甚至在与其他植物的竞争中发挥着重要作用,是植物应对环境胁迫的重要手段[1]。植物会对动物、植物和病原体攻击或其他生物和非生物的胁迫产生反应,而且对于诱导子( 各种来源的小分子)也会作出应答[2]。诱导子可根据来源的不同分为生物诱导子和非生物诱导子两大类。常见的生物诱导子有寡半乳糖醛酸、真菌诱导子、茉莉酸类诱导子和酵母提取物(yeast extract,YE)[3]。而非生物诱导子是指理化因素如紫外线、高温、低温、乙烯、重金属盐类等[4]。诱导子能在植物体内诱发或抑制特定代谢,直接影响到次生代谢物的产量,可有效改善具生物活性化合物的次生代谢情况[1,3]。
目前虽然利用诱导子来促进植物次生代谢产物生产的研究已取得了一些进展,但还存在着很多不完善的地方。在诱导物的作用机制方面,人们只是有大体的推测,并没有很透彻的了解。不过有一个初步的假说得到了大家的认可:即诱导子作为一种外界信号被植物细胞膜上的受体所识别,并与之结合,从而引起细胞膜上及细胞内一系列反应,使与植保素有关的酶合成或活性发生变化,从而引起植物基因表达发生变化,最终导致植保素的合成和积累,这一假说获得了大量的实验证明。诱导子作为外界信号要被细胞识别,首先是通过诱导子与细胞膜上受体的结合来实现的,这一过程会引起膜成分的变化以致引起膜的通透性、膜内离子分布的变化。诱导子作为外界信号作用胞质膜而引起膜上发生变化,到引起胞内基因启动、酶活性改变的过程应该是一个级联过程,这中间需要有物质充当胞内信使,也即第二信使,目前人们由实验推出的主要第二信使包括Ca2 、cAMP、磷酸肌醇、G-蛋白、水杨酸、茉莉酮酸及其甲氧基酯以及植物细胞壁组成成分等。诱导子信号被传递到细胞内以后,通过控制次生代谢途径中关键酶的合成来调节次生代谢产物的合成[5]。
内生真菌是药用植物内环境重要的组成部分,与药用植物长期共进化过程中形成了一种稳定的互利共生关系。内生真菌诱导子能够快速、高度专一和选择性地诱导药用植物特定基因的表达,进而活化特定次生代谢途径,调控药用植物次生代谢物的生物合成,显著促进药用植物活性成分的积累[6]。接下来探讨内生真菌作为诱导子对射干悬浮培养黄酮类成分的影响。
鸢尾科鸢尾属植物射干主要含有12种黄酮类成分,包括新芒果苷(neomangiferin,1)、芒果苷(mangiferin,2)、鸢尾苷(tectoridin,3)、鸢尾新苷B(iristectorin B,4)、鸢尾新苷(iristectorin A,5)、野鸢尾苷(iridin,6)、鸢尾黄素(tectorigenin,7)、鸢尾甲黄素(iristectorigenin A,8)、野鸢尾黄素(irigenin,9)、次野鸢尾黄素(irisflorentin,10)、德鸢尾素(ir-ilone,11)和白射干素 (dichtomitin,12)[7]。
关于黄酮类成分的诱导方面,贺梦真等将拟茎点霉属、尖孢镰刀菌、胶孢镰刀菌3种真菌诱导子添加到龙眼悬浮培养体系中,发现龙眼胚性悬浮细胞在100mg/L的拟茎点霉属真菌诱导子处理下诱导6 d后类黄酮的积累量最高[8]。翟俏丽等将促进白桦三萜积累的不同浓度的拟茎点霉属的内生真菌诱导子添加到不同生长时期的白桦悬浮培养体系中,发现最佳诱导条件为在指数生长期的白桦细胞中添加40mu;g/mL的真菌诱导子诱导1天[9]。
