开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
研究综述
人体中乙醛脱氢酶(aldehyde dehydmgenase，ALDH)主要有两种形式的同工酶，ALDH1和ALDH2。ALDH2广泛分布于人体肝脏，肾脏，心脏，肺，脑等组织中，能把体内乙醇、氨基酸、生物胺、维生素、类固醇等代谢过程中产生的对生物体有害的醛类物质转化，是乙醇代谢途径中最重要的酶之一，因此受到细胞解毒研究方向的高度关注。大量研究表明ALDH2基因具有遗传多态性，其活性变化与氧化应激、乙醇或乙醛蓄积等因素引起的神经系统疾病、酒精性肝病、上消化道癌等疾病的发生密切相关，这些发现使得ALDH2基因型的研究对临床诊断具有了重要意义。
ALDH2是一种位于线粒体基质染色体12q24编码的四连体蛋白，该基因存在高度遗传多态性，为常染色体显性遗传。现已发现ALDH2基因在染色体12号外显子504位点存在一个点突变，表现为G→A的碱基置换，因此ALDH2存在ALDH2*1和ALDH2*2两个等位基因。在正常情况下，ALDH2为同型二聚体，由两个相同的野生型蛋白单体ALDH2*1（ALDH2*1/ALDH2*1）组成。在ALDH2*2携带者体内，突变型单体(ALDH2*2)能与野生型单体共同组装，形成新的二聚体(ALDH2*1/ALDH2*2)，导致ALDH2对短链脂肪族醛类的催化活性明显降低，只有6%的酶活力，而当突变型二聚体（ALDH2*2/ALDH2*2）形成时则完全丧失酶活力[1]。大量统计结果表明ALDH2*2在东亚人群中普遍存在，在中国不同种族间分布频率有差异，同一种族间，也可能存在显著差异，而在美国黑人等人群中频率很低，白种人群中甚至完全缺乏[2]。
Luo[3]等以HardyWeinberg去平衡法对乙醇代谢的相关酶系进行精确定位，发现ALDH2与酒精依赖(alcohol dependence)可能存在密切联系。研究表明，ALDH2*2携带者并不善于饮酒，从而减小了其酗酒的可能性。Lee[4]等对韩国人群的ALDH2等位基因频率进行分析，发现在过度饮酒人群中仅有7．1％的个体携带ALDH2*2，而在非饮酒人群中此比例高达45．3％。但是ALDH2*2携带者由于缺乏酶活性，在机体摄入与ALDH2*1野生型机体等量酒精的情况下，由于无法正常代谢将导致乙醛等醛类物质的积累，最终对机体产生毒性作用，导致上消化道癌、食管癌、肝硬化等疾病，同时由于ALDH2*2携带者缺乏对乙醛有天然免疫作用的生物因子，使得这类人群过量饮酒，更加增大了罹患肿瘤的危险。最近有文献报道ALDH2与硝酸甘油发挥作用有关，ALDH2*2突变型会影响硝酸甘油对心绞痛的治疗[5]。
本课题拟采用分子标记法对ALDH2基因进行检测，目前单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）检测方法具有显著优势，在对已知突变位点检测时，只需对SNP进行两种不同类型碱基的确认分析，而无需对DNA片段进行全序列测定，因此，本课题将主要采用这一方法。近年来关于SNP的检测技术快速发展并呈现多元化，但主要基于以下四种原理：1）等位基因特异性杂交；2）内切酶酶切技术；3）物延伸法；4）寡核苷酸连接反应[6]。虽然SNP检测技术很多，但是同时存在一些缺点：例如焦磷酸测序每个样本位点均需要经PCR扩增再测序，步骤多而分散，工作量大，周期长，成本较高，不适合大样本多位点检测；引物延伸技术中的MALDI-Tof[7]前处理工艺复杂，除杂要求高，适用于已优化的特定SNP检测，不适于该服务商未做过的新SNP检测；dHPLC方法也存在明显缺点，该方法只能判断是否有突变，但不能确定SNP的位置和类型，需要标准样品或结合测序验证，SNP筛查的检测通量和灵敏度较低，成本较高；其他如Taqman探针技术[8]，分子信标技术[9]等也都存在成本高，适用的荧光染料少、需要借助特殊的仪器等问题。本课题将核酸扩增方法和核酸侵入信号放大方法相偶联，使得反应在等温条件下进行，直接对基因组DNA进行SNP检测。
为了进一步发展现有的SNP检测技术，本课题将引入纳米金探针(Gold nanoparticle probe)使检测结果可视化。纳米金作为金的微小颗粒，尺寸lt;gt;，具有由于尺寸效应而表现出独特的物理、化学及生物性质的一类粒子。当普通物质的尺寸降低到纳米数量级时，会导致物质的光、电、磁、热及化学活性等性质与本体物质有明显的不同。表面效应、体积效应、量子尺寸效应及量子隧道效应等等是纳米级物质的基本特性[10]。当金颗粒的尺寸降低到纳米量级时，表现出独特的光学和电学性质。由于纳米微粒尺寸小，电子能级发生分裂。能级之间的间距与粒径大小有关，当能级的间距不同时，具有不同的等离子共振吸收带，当电子从低能级向高能级跃迁时需要吸收特定波长的光，导致溶液呈现出不同的颜色。纳米金颗粒的尺径越大，吸收谱线越靠近红端，溶液的颜色随着粒径的增大而逐渐由红色变成蓝灰色[11]。因此可以利用纳米金作探针进入生物组织内部探测生物分子的生理功能,进而在分子水平上揭示生命过程，而它独特的颜色变化也是其应用于生物化学的重要基础。在传统的基因分析中，需要用到各种标记探针，如放射性元素标记、荧光色素标记及酶标记等探针，采用这些探针进行检测除了操作复杂、费时外，它们各自都还存在着一些不足之处: 放射性元素探针虽然灵敏度较高，却存在着放射性危害等安全隐患; 荧光色素探针价格昂贵，且存在着光漂白、光解等缺点; 酶标记探针中的酶本身容易失活，不便长期保村[12]。将纳米金与生物活性分子结合成探针应用于基因分析中，这种探针在光谱特性、光化学稳定性，以及对靶基因选择特异性等方面都超过了传统的荧光探针，同时具有检测模式操作简便，耗时短，费用低廉等诸多优点。本课题通过引入纳米金探针，简化操作步骤，避免检测过程中的污染，同时具有高特异性，检测结果可视化，稳定性更高等优点。
解决的问题
将核酸扩增方法和核酸侵入信号放大方法相偶联，再结合纳米金可视化检测，实现对ALDH2基因快速灵敏的分型检测，为临床诊断提供新的低成本检测方法。
研究方法
