一、论文选题的目的、意义
在抗生素被发现之前，细菌感染是人类死亡的第一大杀手。自抗生素被发现并应用于多种细菌感染性疾病的治疗以来，人类的寿命延长了10~15年。因此，抗生素被誉为二十世纪最伟大的医学发现。然而，由于抗生素的广泛使用甚至滥用，医院和社区中出现了大量的耐药病原菌，医院已经成为产生耐药菌株的温床。近三十年来，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染率和分离率不断上升。早在2005年，美国因感染MRSA死亡的人数超过了同期因患艾滋病而死亡的人数，MRSA感染已经被列为世界三大最难解决的感染性疾病之首。传统的超级细菌大多是多重耐药性的，即同时对多种抗生素具有抗性。2010年，新德里爆发的耐金属beta;-内酰胺1（NDM-1）的超级细菌对绝大多数临床上使用的抗生素不敏感，属于泛耐药性。目前，NDM-1感染已蔓延至全球多个国家，感染死亡率高达30-60%。2011年8月，美国26个州爆发沙门氏菌感染疫情。同时，名为肯塔基的超级沙门氏菌恐荒蔓延全球。在我国，根据2008年的统计数据，细菌感染性疾病占疾病总数的21%，耐药菌致死率高达12%，每年因耐药菌感染所造成的经济损失多达百亿元[1]。2011年统计数据显示，美国的耐药细菌感染每年会导致约200万人入院治疗，近10万人死亡，产生200亿到300亿美元的治疗费用[2]。
细菌耐药性可通过多种途径产生，例如产生beta;-内酰胺酶、细胞膜通透性的增加或减少、启动主动外排系统、靶位修饰和酶降解药物使其失活等。同时，细菌可以通过基因水平转移将耐药基因在不同类的细菌间传播。如今耐药菌已经呈现出种类繁多、耐药面宽、耐药率高、多重耐药与交叉耐药、耐药机制多样等特点，给细菌感染性疾病的治疗带来更大的困难。目前，对抗生素有很强抗性的超级细菌感染的频繁爆发已引起广泛关注。各国政府部门纷纷启动多种方案密切关注抗生素合理使用和加速基础研发，积极应对耐药菌的蔓延。2010年，美国传染病学会推动了一项全球性的抗生素研发倡导运动10 ′20，计划到2020年，全球有10种新类型的抗生素上市。2011年，我国政府拟出台史上最严格的抗生素限用管理法令，以加强对临床抗生素滥用状况的改善，表明我国对耐药菌的重视已经上升到国家战略层面。2011年，欧盟制定未来5年全面应对致病菌耐药性行动计划，加强抗菌药物的使用监督和社区细菌感染的预防，加强对耐药菌的研究力度。同年，法国卫生部提出国家抗生素警戒计划，加强潜在的抗生素替代疗法等应用基础研究。世界卫生组织把2011年世界卫生日的主题定为抵御耐药性今天不采取行动，明天就无药可用，并且将耐药菌感染确定为人类健康的三大威胁之首。
二、文献综述与国内外研究动态
细菌耐药性可通过多种途径产生，例如产生beta;-内酰胺酶、细胞膜通透性的增加或减少、启动主动外排系统、靶位修饰和酶降解药物使其失活等。同时，细菌可以通过基因水平转移将耐药基因在不同类的细菌间传播。目前，细菌的管家基因仍然被公认是基于靶标的抗菌筛选的最理想选择。随着全基因组测序技术的日新月异，目前已经有几百种细菌菌株的基因组得到了测序。生物信息学分析可以预测这些基因表达蛋白的功能以及对细菌生存的重要性。Payne等预测抗菌的潜在作用靶标应该有160个。这些靶标具备两个特点，一是细菌的管家基因，二是宿主中不存在同源基因。根据2006年发表的统计数据，目前上市药物中针对病原体的作用靶标总数为58个，其中包括真菌，病毒等[11]。Lange等分析认为目前已知抗菌药物的作用靶标大约为40个，包括传统抗生素的经典作用靶标，例如细胞壁的生物合成、细胞膜的功能、蛋白质、核酸的生物合成等。这些数据表明，还有相当数量的管家基因可以作为抗菌新靶标来进一步开发。
YycG/F(WalK/R)双组份系统在一系列革兰氏阳性菌的细胞壁代谢中发挥关键作用，直接影响肽聚糖合成和调控生物被膜的形成[37]。Jiang等利用同源模建技术构建了表皮葡萄球菌YycG的ATP结合域结构，针对SPECS化合物库开展虚拟药物筛选，得到了七种可以抑制表皮葡萄球菌生长的化合物[38]。六种化合物与YycG蛋白具有高亲和力并抑制磷酸化反应。YycG001等能够有效抑制金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌和链锁状球菌的生长。Utsumi等从天然产物花姜酮的衍生物筛选得到了具有抑制YycG双组份调节系统功能的化合物YycG034，可抑制MRSA和耐万古霉素粪肠球菌的生长[39]。Utsumi等利用增强型绿色荧光蛋白筛选系统对两类化合物库进行高通量筛选，得到了两种影响转录因子YycF表达的新型抗生素walrycin A ，walrycin B，对MRSA具有抗菌活性[40]。此外，金黄色葡萄球菌YycG/F双组份系统中的转录因子YycF晶体结构已经得到了解析，为基于结构的药物设计提供有力的依据[41]。YhcS/R双组份系统也是金黄色葡萄球菌生长所必需的，其表达下调会抑制细菌生长[42]。目前为止，这两组细菌必需的TCS正在成为充满吸引力的抗菌新型靶标。另外，病原菌的致病性和耐药性都依赖于其它一系列的TCS，虽然并不像YycG/F一样为细菌生存所必需，针对该类TCS的抑制剂可以减弱细菌毒性，增强对抗生素的敏感性，也是极具潜力的抗菌药物作用靶标，例如与细菌粘附和侵袭有关的SaeS/R系统[43]，以及介导对万古霉素产生抗性的VanS/R系统[44]。
以往人们认为抑制TCS中保守的组氨酸激酶结构域作为靶标更加有效，虽然细菌TCS的信号转导通路和分子作用机制通常在宿主中并不存在，但是许多组氨酸激酶抑制剂对TCS选择性比较差，而且宿主内有大量的激酶，针对TCS激酶的抑制剂难免会同时作用于宿主激酶对宿主产生副作用。由于病原菌激酶还拥有独特的胞外信号感应结构域，目前众多抑制剂的研发转向针对组氨酸激酶的感应功能域。然而目前感应结构域的信号转导机制尚不明确，况且多个TCS彼此之间还有相互作用，这些无疑都增加了选择性地调控信号转导的难度。因此针对细菌必需的TCS的广谱抑制剂的发现还需要持续的努力，同时非必需的TCS也可以作为抗-致病力的抗菌靶标来加以研究。
三、研究方法
1结构域分析2水溶性分析3 PCR扩增4 酶切连接5阳性菌落质粒测序6快速蛋白液相色谱(FPLC)纯化蛋白 7蛋白结晶筛选 1）添加剂（additive）优化晶体 2）限制性酶切--筛选稳定的截短蛋白 3）热稳定性分析-筛选合适的蛋白缓冲液
