开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
1.实验背景
骨质疏松症系以慢性腰背疼痛，甚则畸形、骨折为主要表现的一种全身性骨量减少性疾病，会大大降低人的平均寿命和生活质量。随着全球老龄化的到来，骨质疏松症越来越受到医学界的重视。WHO统计表明，世界范围内骨质疏松症患者总数超过2亿人，我国现有骨质疏松症患者约7000万人。据国际骨质疏松症基金会（IOF）统计，到2020年，仅我国内地就将有2.86亿人患骨密度过低或骨质疏松症，到2050年这一数字将上升到5.33亿人。
常用于治疗骨质疏松症的药物有二膦酸盐制剂（BP制剂）、选择性雌激素受体调节剂（SERM制剂）、RANKL拮抗剂和活性维生素D3制剂等。其中最常用的是BP制剂，但美国食品药品监督管理局（FDA）在2010年1月13日发布信息，称所有的BP药物说明书的警示部分均会添加用于治疗骨质疏松症时可能出现大腿骨的非典型骨折风险的信息。SERM制剂可能造成深静脉血栓栓塞。活性维生素D3制剂在改善骨代谢、增加骨密度和防止新椎体骨折方面的效用不及BP制剂和SERM制剂，但其具有安全性高、服用限制少和顺应性好等优点。
活性维生素D3的合成法主要包括热化学合成、微生物发酵及生物转化三种方式,化学合成法是目前获得活性维生素D3的主要生产方式,由于涉及多步复杂的化学反应过程,且分离纯化过程复杂,目的产物收率低。微生物发酵法是利用代谢工程手段以酿酒酵母细胞为底盘细胞,通过敲除ERG6及ERG5基因,将麦角固醇合成通路转变为胆甾醇合成通路,结合酿酒酵母细胞高密度发酵技术获得生产活性维生素D3的关键中间体胆甾5,7,24-三烯醇的累积,但由于链甾醇在酿酒酵母甾醇合成代谢比例低,代谢途径复杂,众多副产物的累积加重了目的产物的纯化难度。生物转化合成以维生素D3为底物,早期以野生菌株中内源性的P450羟化酶催化维生素D3的C-1位及C-25位发生羟基化合成活性维生素D3,目前筛选获得具有维生素D3羟化能力的野生菌包括链霉菌属(Streptomyces)、诺卡氏菌属(Nocardia)、分枝杆菌属(Mycobacterium)等多种微生物,但野生菌转化体系中存在酶活低、选择性差等缺点,导致反应周期长,底物浓度及转化率较低。
近年来，随着基因工程技术在生物转化中的广泛应用，关于细胞色素P450单加氧酶结构与功能的研究相继展开，具有高活力及高选择性的维生素D3羟化能力的单加氧酶被相继克隆，并在重组细胞中实现活性表达。相较于传统的野生菌转化体系，该工艺能够有效提高反应体系中的底物浓度、转化率并显著降低反应时间。由此，利用分子生物学手段，在重组细胞中构建维生素D3羟化反应的关键酶体系，是实现活性维生素D3高效合成的有效手段。
2.文献综述
目前研究较多较为成熟的生物转化制备骨化醇类药物依旧是真菌类。Sasaki等筛选出两株活性菌株—菌核链霉菌FERMBP-1370和玫瑰孢链霉菌FERMBP-1574,其分别以25-OH维生素D3和1alpha;-OH维生素D3为底物,转化生成1alpha;,25-二羟维生素D3。两株菌的1alpha;-羟基化的平均反应速率分别为7.0mu;g/L·min和6.9mu;g/L·min,转化率均为10.2%左右。Sasaki等筛选出12株具有将维生素D3转化为1alpha;,25-二羟维生素D3能力的菌株。首先在25-位羟基化生成25-OH维生素D3(转化率为8.3mg/L),随后1alpha;-羟基化进而生成1alpha;,25-二羟维生素D3(转化率为0.17mg/L)。郑东虎等用暂命名为TN-955的活性放线菌菌株将维生素D3转化为25-OH维生素D3。发酵培养基的主要成分为1%淀粉、1%麦芽糖。具有转化活性的野生型菌株,其转化能力较弱。而对菌株进行诱变处理,获得的突变株具有较野生型更高的羟化酶活性。Fujii等从自养假诺卡式菌NBRC12743中分离得到特异的维生素D3羟化酶基因vdh。经随机诱变将4个氨基酸替换整合获得vdhK1突变菌株,其含有的羟化酶比野生型菌株活性更高。将vdh基因整入红平红球菌基因组中,vdh基因成功表达,将维生素D3转化为活性维生素D3。
近年来,关于P450酶结构与功能的研究越来越多,为其表达基因的相关研究奠定了基础,从而使基因工程技术在生物转化中的应用更加广泛。CYP27B1是25-OH维生素D3的1alpha;-羟化酶,催化1alpha;,25-二羟维生素D3的合成。20世纪90年代,日本就成功地将人和小鼠的CYP27B1基因克隆在大肠杆菌中。随后,Uchidaa等等将大肠杆菌的分子监控蛋白GroEL/ES过表达,发现CYP27B1的表达水平远高于野生型。目前已有学者利用基因工程方法改造P450酶特异调节基因从而构建具有高度专一性和高转化率的基因工程菌,Sugimoto等通过对浅灰链霉菌的定向诱变得到R84A突变株。通过对R84A的CYP105A1的结构分析,提出了活性维生素D3的两步羟基化的反应机理,发现其25-羟基化作用是野生型的32倍。柯霞等构建了来源于自养无枝酸菌VD3 羟化酶及来源于不动杆菌的 铁 氧 还 蛋 白 Fdx 及铁氧还蛋白还原酶 FdＲ 的重组表达载体pET28b-Vdh、pET28b-FdＲ-Fdx，并以大肠杆菌为宿主细胞，体外诱导表达并通过镍柱纯化三种蛋白质，通过 CO 差光谱法评价羟化酶Vdh体外活性，并利用2，6-二氯靛酚钠( DCIP)和细胞色素c作为电子受体评价电子传递链FdＲ-Fdx对NADH和NADPH的氧化活性及与羟化酶Vdh 的偶联作用，最后利用Vdh及其电子传递链催化维生素D3的选择性羟化合成25( OH) VD3。
影响产率的主要因素为P450的可溶性表达和底物的溶解度。维生素 D3是脂溶性化合物, 在发酵液中的溶解度很低 ,导致转化率很难达到工业生产水平。将维生素 D3溶解于乙醇后再加入发酵液中已成为常用的添加方式。提高维生素 D3在发酵液中的溶解度的方法 ,主要是向底物中添加表面活性剂或对维生素 D3进行包埋处理增加其水溶性,常用的增溶剂有 beta; -环糊精和部分甲基化的环糊精。Takeda等通过向底物中添加部分甲基化的beta;-环糊精的包埋方式,利用自养无枝酸菌将 25-OH维生素 D3的转化率 (8.3 mu;g/mL)提高到 16 mu;g/mL, 将 1alpha;, 25-二羟维生素 D3的转化率(0.17 mu;g/mL)提高到 2 mu;g/mL。P450 BM-3 催化时能独立完成电子的获得、传递和底物的羟基化，而其他来源的 P450 酶必须通过P450还原酶的辅助才能完成催化作用。但是P450 BM-3分子量大(119kDa)、结构复杂，在大肠杆菌中进行重组表达时，表达量低且易于形成包涵体。张彭湃等的实验中发现，乳糖和IPTG可以可显著提升 P450 BM-3 在大肠杆菌中的重组表达水平，并且能够促进 p450 BM-3 的可溶性表达。
