课题名称 单克隆抗体-一氧化氮供体偶联物ANC-3的制备、表征及体外抗肿瘤活性的鉴定课题性质 radic;基础研究应用课题 设计型 调研综述 理论研究开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）研究课题：抗体偶联药物是结合抗原抗体特异性与小分子细胞毒性药物的一种新型治疗手段，通过其特异性地投放药物到肿瘤细胞，以求最大化疗效和最小化毒副作用。
本课题研究一氧化氮供体定点偶联产物ANC-3的制备方法并初步检验其体外活性。
借鉴基因泰克公司的TDC技术在C-04抗体特定位点上引入半胱氨酸突变，使用哺乳动物细胞进行anti-C-04抗体的发酵表达，通过TCEP还原、DHAA复氧化等步骤将NO供体定点偶联到anti-C-04的半胱氨酸突变位点上得到ANC-3。
随后用HIC-HPLC鉴定ANC-3的纯度以及通过计算峰面积来测定ANC-3的平均药物偶联比DAR。
并用SEC-HPLC检测ANC-3在储存液中的聚集情况。
对于ANC-3体外活性的初步探究采用流式细胞仪检测ANC-3与肿瘤细胞的结合情况，MTT实验检测ANC-3对肿瘤细胞的杀伤，荧光探针检测NO在肿瘤细胞内的释放。
研究手段：1.C-04蛋白表达纯化：获得含目的基因的质粒，转染动物哺乳细胞，诱导其表达所需C-04抗体蛋白经ProteinA柱层析、SDS-PAGE和Western blotting制备并纯化的蛋白2.C-04-NO供体偶联物ANC-3的制备：借鉴基因泰克公司的TDC技术在hCD24抗体特定位点上引入半胱氨酸突变，使用HEK293细胞进行anti-C-04抗体的发酵表达，通过TCEP还原、DHAA复氧化等步骤将NO供体定点偶联到anti-C-04的半胱氨酸突变位点上得到ANC-3。
蛋白质的纯化：先用Protein A柱洗脱蛋白质，随后进行SDS-PAGE凝胶电泳：按比例配置浓缩胶与分离胶，对获得的蛋白进行凝胶电泳，分离的蛋白质再通过转膜处理后，再对蛋白质进行Western blotting鉴定ANC-3的鉴定：用HIC-HPLC鉴定ANC-3的纯度以及通过计算峰面积来测定ANC-3的平均药物偶联比DAR。
用SEC-HPLC检测ANC-3在储存液中的聚集情况。
