一．拟解决的问题：
巨噬细胞是机体的重要防御细胞。大量研究已证明巨噬细胞在吞噬与清除异物和衰老死亡细胞、分泌生物活性物质,调节血细胞生成与参与免疫应答等方面发挥着广泛的生物学作用。深入研究巨噬细胞的生物学功能不仅能阐述诸多生理与病理生理学机理,而且对临床相关疾病的治疗也有重要价值。深入探讨巨噬细胞生物学功能的前提或核心问题是如何获得高纯度、高活性的巨噬细胞。尽管国内外不少文献报道已能从多种组织和器官中 分离、纯化巨噬细胞,但这些方法十分繁琐、复杂,且所需时间较长,耗资较大。为研究一种既简便又经济的巨噬细胞分离与纯化的方法,我们通过诱导骨髓细胞分化,希望建立骨髓巨噬细胞的分离、纯化、培养和鉴定方法,为研究巨噬细胞的生物学功能奠定了基础。
二、研究目标、采用的手段
- 研究目标：
为深入研究骨髓巨噬细胞的生物学功能,探索一种简便的骨髓巨噬细胞的分离,纯化和培养的方法。
- 研究手段：
- 小鼠骨髓巨噬细胞的制备
- 预先配制培养液:30%L929上清 60%DMEM 10%血清。
- 取C57小鼠颈椎脱臼处死，于75%乙醇浸泡10min,拎出后将小鼠铺于超净 台 上一个消毒托盘上，用眼科镊小心捏起小鼠两髋关节之间的腹部皮肤，用眼科剪 小心剪开皮肤，并分离两下肢的皮肤，往下在脚踝处剪断，往上在髋关节处剪断，游离出小鼠的两条下肢。
- 去除下肢皮肤及软组织，分离双股，取双侧股骨于胫骨。仔细分离肌肉肌肉等组织，完整暴露固骨质，离断两端。
- 小心用预先灭好菌的1乘PBS冲洗骨髓至1.5ml离心管内。拿一支1ml的无菌注射器，每支吸取1ml灭菌1乘PBS液，轻轻插入骨髓腔，冲洗骨髓腔以获得骨髓，一般用2-3mlPBS冲洗两次，可冲出绝大部分细胞。
- 1500rpm离心5min，培养液重悬骨髓细胞，均匀接种于10 cm 大皿内。
2. 骨髓单核细胞诱导分化及鉴定
- 将大皿内细胞培养过夜，以去除贴壁较快的其他杂细胞如纤维细胞等等。 收集未贴壁细胞按实验设计安排种入皿或细胞培养板内。
- L929上清以30% 浓度刺激使骨髓细胞向单核巨噬细胞分化。
培养7-8 d，光镜下观察巨噬细胞形态变化，并于第8 天流式检测巨噬细胞的分化情况。
- 巨噬细胞形态学检查
- 倒置显微镜观察
在接种巨噬细胞后的1～ 4 天分别观察贴壁细胞形态。
- 光学显微镜检查
取已铺满细胞的玻片, PBS冲洗去掉表面的悬浮细胞, 晾干后进行Wright′s 染色, 光学显微镜下观察。
- 电子显微镜检查
用橡皮刮刀将培养皿上的细胞刮下, 离心洗涤后, 用2.5 %戊二醛固定。按常规方法制备半薄切片、超薄切片, H600 型透射电子显微镜观察并拍摄照片
- 巨噬细胞吞噬功能检查
- 墨汁吞噬试验
待贴壁细胞铺满皿底时, 在培养体系中加入10%墨汁0 .05ml, 培养箱中孵育3h , 用PBS洗去悬浮的墨汁颗粒, 晾干, Wright′s 染色, 镜下计数200 个细胞, 计算其吞噬率及吞噬指数。
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