开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、拟研究的问题
枯否细胞( Kupffer cells,KCs) 是位于肝脏的肝血窦内，固定于窦壁，是机体单核巨噬细胞系统主要组成部分，占全身单核巨噬细胞总量的 80%~90%，也是肝脏炎症反应中主要的效应细胞，发挥着重要的免疫调节功能，研究 KCs 的功能，对阐明 KCs 相关疾病的发病机制具有重要作用，但 KCs的分离培养比较困难，在一定程度上阻碍了对 KCs相关疾病的研究KCs分离、培养方法的不断改进，可以为研究各种肝病奠定基础，具有重要理论和现实意义。
枯否细胞与一般的巨噬细胞不同，它能吞噬来自血液循环的抗原抗体复合物和其他有害物质，以消除这些物质对机体的损害，因此不具有增加抗原免疫原性的能力，反而有消除或减弱抗原性的作用。因不同细胞及待分离物质量不同，可以通过梯度离心将枯否细胞与其他细胞及杂质分开，并通过用流式来分选鉴定库否细胞，从而为后续科学研究提供细胞模型。
目前国内外分离、培养KCs的方法比较多，有选择性贴壁法，免疫磁珠法，流式细胞术分离法，密度梯度离心法等。磁珠分离法价格昂贵，有些实验不易操作，比如分离肝脏并保留门静脉及下腔静脉，离体后再插管或将已经固定插管的门静脉剥离。在实际的操作过程中，容易使插管滑落或插破血管从而导致实验失败，选择性贴壁法则很难提取到高纯度的KCs，诸如此类的研究报道很多，各有差异，且存在不足之处。本研究旨在吸收了相关研究中的精华之处，综合形成的一种高效、稳定，尤其是易于操作的KCs的提取、培养方法。
二、研究目标、采用的手段
- 研究目标：
肝脏KCs作为体内最大的巨噬细胞群，在全身炎症反应的发生、发展中起十分重要的作用，现在对肝脏KCs的研究越来越多，本次试验旨在摸索出一套高效、稳定并且易于操作的分离、培养方法。
- 研究手段：
在探究肝脏病变变得不同时期其免疫细胞的含量变化，因此对于肝脏枯否细胞的分离和鉴定是实验中重要且基础的一个步骤。在本次试验中，我们的具体步骤如下：
- 每只小鼠注射0.1~0.15mu;l乌拉坦麻醉。
- 现将静脉滞留针中空气排出，在37度的恒温保育箱中通过从下腔静脉灌流DMEM冲洗2min将血从门静脉冲出，直至肝脏成为土黄色。
- 灌流EGTA冲洗6~7min（肝癌需冲洗时间长一点），同时用止血钳夹住门静脉，使EGTA在肝脏内滞留时间较长。
- 用胶原酶将组织分散成为细胞。
- 将肝脏去除胆囊，移至10cm培养皿，加入细胞培养基，剪掉结缔组织并搅匀。
- 轻轻的将细胞吸到100um滤网上，用DPBS冲洗滤网。
- 将滤下的液体用DPBS -/-补齐至30ml。
- 50xg 4°离心2min将上清的实非质细胞收集至新的50ml离心管。
- 将体积补齐至50ml，50xg 4°离心2min，底部沉淀为肝细胞丢弃。
- 将上清的实非质细胞收集至新的50ml离心管。
- 将体积补齐至50ml，50xg 4°离心10min，底部沉淀为肝细胞丢弃。
- 将上清的实非质细胞收集至新的50ml离心管。
- 将体积补齐至50ml，200xg 4°离心10min，底部沉淀为肝细胞丢弃。
- 室温分别准备50%，20% percoll液。
- 将15ml锥形管加入4mls 50%percoll再加入4ml 20%percoll。
- 用1mlsDPBS -/-重悬离心得到的细胞，轻轻加入到20%percoll液面上。
- 500xg室温离心20min（with brake off）。
- 取中层细胞用20~30ml DPBS-/-重悬，洗2次。
- 将细胞铺板，2小时后细胞粘附在板上，用PBS清洗2次，进行后续试验。
a.上层为死细胞
