开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 研究背景
DARPins (Designed Ankyrin Repeat proteins) 蛋白为一类设计的锚蛋白重复序列蛋白，其本身即在人体内广泛存在，其天然的生物学功能为与靶蛋白结合，产生生物学激活或抑制效应。但作为类抗体偶联药物的靶头，其高亲和力是十分必要的因素。
DARPins是基因工程抗体类似蛋白，典型地显示出高特异性和高亲和力的靶蛋白结合能力，能够被选择性的结合任何具有高亲和力和特异性的目标蛋白，是一类新型的有潜力的克服的单克隆抗体的局限性的结合分子。它是小的、单结构域蛋白，至少由3个，通常是4个或者5个重复的蛋白序列组成。对于一个有4或5个的重复DARPins,分子量大约是14或18kDa。它不具有效应子功能，但对于许多应用（尤其是在肿瘤病）可能需要不同的效应子功能，通过加入效应子功能来装备DARPins。DARPins被使用旨在用于研究、诊断和治疗的工具。2010年，第一个这样的分子，编号MP0112，进入临床试验。在研究中已发现多种用途，由于其高稳定性和强大的折叠，允许有许多新的分子形式。
DARPins的特色是拥有一个由不同数目结构基元（重复）堆积成重复蛋白结构域的蛋白建筑，重复蛋白的天然生物功能是与一个靶的结合，从而导致不同的作用模式，从酶抑制到蛋白彼此之间的简单锚定。这些特性使得它们成为理想的激动、拮抗或抑制性药物候选物。此外，DARPins能被人工改造以携带各种效应子功能或综合多种结合特异性，使其具有完全新的药物形式。综合来说，DARPins是具有超过现有抗体药物潜能的新一代蛋白治疗药的突出的一员。DARPins可开发成优于抗体的具有拮抗性甚至激动性的药物。由于单价DARPins分子小得多，因此预计它的组织渗透性会显著改善。它阻滞临近作用部位的配体或毒素，并产生更强的抑制作用。其次，DARPins不携带Fc部分，避免了与免疫系统直接连接。其结果是，由于在单价DARPins中不存在效应子结构，所以有可能使给药剂量大幅度提高。第三，在于DARPins从组织或循环中迅速清除多余分子的能力。因为DARPins配体复合体主要通过肾清除，因而能较快地从循环中消除。这对DARPins有重大意义，如果它被用于中和毒素，单价DARPins相对快的清除可被PEG化，与血清蛋白DARPins融合或缓慢释放减慢。这使得可对药代动力学进行调节以达到最大生物效应。
作为对自然进化的体外模拟, 蛋白定向进化是改进蛋白功能与活性的有效手段。按照创造突变的方式, 定向进化可采取随机、半理性和理性等策略来进行。理性和半理性策略是在弄清蛋白质空间结构, 特别是活性位点和构效关系的基础上, 针对活性位点来设计和改造蛋白质。而通常所说的“定向进化”则多指采用随机方式构建包含大量突变的文库并对之进行定向筛选的过程。由于这一策略在不需要了解蛋白质空间结构和构效关系的情况下就能获得所需的性质和功能, 因此也是目前应用较多的蛋白质改造手段。随着分子生物学技术的不断发展, 特别是PCR 和基因重组技术的应用, 定向进化已从在体内转为在体外进行, 实验方法也变得简便、快速和高效, 而高通量筛选和体外展示技术的发展更进一步拓展了体外定向进化的应用范围, 使一些原本操作起来耗时耗力或难以进行直观筛选的蛋白质分子也能够得到改造。
- 研究目的和意义
本课题拟对数据库中的多条DARPin蛋白氨基酸序列进行比对后，确定蛋白的结构区及可变区并进行随机突变，通过细菌表面展示技术将设计得到的含突变位点的氨基酸序列表达于大肠杆菌表面，筛选出与PD-L1高亲和力的DARPin序列。
- 实验内容
1. 细菌表面展示DARPin库的建立
-
- 同源模建确定DARPin库氨基酸序列
通过SMART数据库获得氨基酸序列库，同源比对后确定DARPin重复单元的保守区及可变区，通过swiss model模建确定DARPin结构稳定性。
-
- 目的基因DARPin的获得与建库
Overlap-PCR得到重复单元AR，经多轮酶切连接PCR完成DARPin的DNA骨架，与表达载体pBAD-OmpA连接，转化进入大肠杆菌DH10B后涂板，挑单克隆测序，确定库容突变位置序列的多样性。
2. 与PD-L1高亲和力DARPin的初步筛选
