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课题 名称 |
基于质量偏移法表征药物-靶标蛋白互作的高级结构变化 |
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论文的背景、目的和意义 |
一．背景 药物靶标的发现和验证对新药研发至关重要，是药物筛选及药物定向合成的关键因素之一。传统的靶标发现与验证技术如计算机模拟方法，计算量巨大且受筛选的数据库限制，无法直观表征药物与靶标的结合。 本课题依据药物与其靶蛋白结合后往往引起靶蛋白功能性的结构变化的原理，通过对蛋白氨基酸进行共价修饰结合高分辨的质谱技术研究蛋白标记活性和位点，可直观的观察到药物与靶标的结合，在发现与确证新靶标的同时，来探究药物结合靶蛋白的高级结构。 MS是一种功能强大可提供更多蛋白结构信息的工具，相比于X-ray，NMR等方法，对于蛋白的大小，溶解度和纯度有着较低的限制，更适用于复杂样品成分中蛋白结构的测定。常见的联合质谱表征蛋白结构与相互作用的方法有化学交联结合质谱技术（简称交联质谱法），氢氘交换质谱法。交联质谱法利用交联剂处理蛋白样品，将空间距离足够接近、可以与交联剂反应的两个氨基酸以共价键连接起来，然后利用基于质谱技术的蛋白质组学手段分析交联产物。但交联剂往往存在着交联效率，成本，可溶性等一系列问题，且该方法谱图鉴定困难，给后期处理带来极大困难。氢氘交换质谱法则是通过质谱检测确定蛋白质不同序列片段的氢氘交换速率，从而得出蛋白质空间结构信息。但此方法不能够提供精确的蛋白空间结构，成本较高，且会出现回复交换的现象，影响结果准确性。 近期，有文献报道用蛋白氨基酸的共价修饰与高分辨的质谱技术相结合来表征蛋白-蛋白复合物中氨基酸残基的高级结构及蛋白-蛋白相互作用，通过测定不同氨基酸侧链的反应活性，将蛋白的高级结构信息转化为质谱可解析的质荷比（m/z）,从而间接表征蛋白分子的高级结构。蛋白特定氨基酸共价修饰与交联剂等其他修饰方法相比，其标记效率高,定量结果可靠,操作便捷,成本低廉，且质谱数据信息的后期分析简单方便。 |
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论文的背景、目的和意义 |
在本课题中，我们依据配体药物与蛋白受体的结合引起靶蛋白局部或整体结构的变化，从而导致蛋白氨基酸侧链溶剂可及性的不同，即用化学共价标记试剂进行标记的效率不同的原理，通过化学共价标记策略表征由于配体结合引起的蛋白结构变化，并将此用于药物靶标的发现与确证。 二、目的和意义 本课题旨在建立一种新的集靶标发现及确认、结合位点探索于一体的方法学，选用模型蛋白，进行还原性二甲基修饰蛋白中赖氨酸位点，再结合高分辨的质谱技术研究蛋白甲基化标记活性和位点，以阐明不同环境中蛋白结构的变化，找寻由药物结合引起的结构变化的靶蛋白，用于药物靶标发现。 本课题选用BSA，溶菌酶，RNA酶作为模型蛋白，通过比较模型蛋白在无配体和有配体存在的条件下二甲基化效率的差异，阐述由于配体的结合导致的蛋白高级结构的变化,同时揭示由于配体结合引起结构变化的氨基酸位点。 |
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论文的研究方法、研究内容 |
1. 蛋白二甲基化修饰的时间动力学特征 100倍过量的甲醛被用于蛋白二甲基化。模型蛋白，与配体结合的模型蛋白分别与甲醛和BPC混合后，于37℃反应10-60min,50mM碳酸氢铵终止反应，取40ug蛋白加入尿素变性后经DTT还原，IAA烷基化，加入糜蛋白酶酶解，剩余蛋白样品加入0.1%继续终止后-20℃冻存用于蛋白水平进样。 2.蛋白二甲基化修饰的剂量依赖性 模型蛋白，与相应配体结合的模型蛋白分别与10-1000倍过量的二甲基化试剂37℃反应30min,终止后的操作同前。 3.仪器测定与数据处理: 3.1蛋白水平测定二甲基化修饰程度 蛋白样品经C4柱富集后采用ESI Triple-TOF 5600四级杆飞行时间质谱仪进行分析，BioPharmaview软件去卷积计算蛋白分子量，根据平均相对分子质量得出蛋白二甲基化的氨基酸个数。 3.2肽段水平检测二甲基化氨基酸位点 样品经 Nano-LC-Triple-TOF-MS 质谱系统进行分析。蛋白样品通过 0.1% 甲酸以 40 uL/min流速经反相色谱柱C18 colum(150 mmtimes;75um，3mu;m，孔径：300Aring;，Eksigent) 在nano．HPLC高效液相色谱系统上进行第二维分离 经载样柱富集后，采用分析柱分离。分离后肽段，采用配备 nanoSpray reg;III Source 的 Triple TOF 5600 型四极杆飞行时间质谱仪（ AB SCIEX）分析。每组样品重复分析鉴定3次,3次质谱结果合并后做为这组样品的总质谱结果。 进样原始数据经 Analyst TF 软件（AB SCIEX）收集后，经 ProteinPilot 软件（AB SCIEX）分析。基于模型蛋白肽段序列，比对肽段图谱，搜索二甲基化位点。 |
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预期的结果 |
1.蛋白水平检测二甲基化修饰程度 配体结合的模型蛋白由于配体的位阻效应导致其二甲基化水平降低，经而甲基化修饰的平均相对分子质量小于自然状态的模型蛋白。 2.肽段水平检测二甲基化修饰位点 位于配体结合口袋附近的赖氨酸由于位阻效应其二甲基化水平降低，而配体结合对其他部位的赖氨酸二甲基化的影响较小。 结论：以上结果表明蛋白二甲基化方法可以表征由于配体结合而引起的蛋白构象的变化，同时揭示由于配体结合引起结构变化的氨基酸位点。 |
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论文拟撰写的主要内容 |
1.前言 2.本论 2.1试验材料 2.2试验内容 2.2.1蛋白二甲基化修饰的时间动力学特征 2.2.2蛋白二甲基化修饰的剂量依赖性 2.3试验结果 2.3.1蛋白水平测定二甲基化修饰程度 2.3.2肽段水平检测二甲基化氨基酸位点 2.4分析讨论 3.结论 三.参考文献与注释 |
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论文的理论依据 |
模型蛋白BSA（含583个氨基酸的单链，分子量66000g/mol每个BSA分子含17个二硫键和1个游离巯基，配体钙离子，一个BSA分子可以结合4个钙离子），此蛋白常用于研究蛋白结构变化的工具蛋白，可用于二甲基化表征蛋白高级结构方法的验证。 甲基化修饰不改变赖氨酸电荷性质，因此对蛋白结构没有影响，是特定氨基酸（赖氨酸）修饰。位于蛋白结构不同位置的氨基酸侧链其溶剂可及性存在差异，蛋白外表面的自由赖氨酸往往比隐藏于内部结构的赖氨酸更容易接触甲基化试剂且更快被标记上. 在配体存在时，在配体结合口袋附近的赖氨酸可能由于位阻效应导致其二甲基化效率降低；或者由于配体的结合引起蛋白构象转变而导致某些赖氨酸位点甲基化效率的差异。因此可通过蛋白赖氨酸侧链二甲基化标记效率的不同来表征的蛋白的表面结构。 |
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参考 文献 |
[1]Uwe Rix amp; Giulio Superti-Furga.Target profiling of small molecules by chemicalProteomics. Nature chem biol.2009 September 5(9): 606 -624 [2]Brett Lomenick, Gwanghyun Jung, James A. Wohlschlegel, and Jing Huang.Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).Curr Protoc Chem Biol. 2011 December 1; 3(4): 163–180. [3]Ye Zhou,Yue Wu,Mingdong Yao.Probing the Lysine Proximal Microenvironments within Membrane protein Complexes by Active Dimethyl Labeling and Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2016, 88, 12060-12065 [4]Biron, V. L.; McManus, K. J.; Hu, N.; Hendzel, M. J.; Underhill,D. A. Dev. Biol. 2004, 276, 337-351. [5]Vanessa Leah Mendoza,Richard W. Vachet.PROBING PROTEIN STRUCTURE BY AMINO ACID-SPECIFIC COVALENT LABELING AND MASS SPECTROMETRY.Mass Spectrometry Reviews, 2009, 28, 785–815 [6]Paul J Boersema, Reinout Raijmakers, Simone Lemeer, Shabaz Mohammed1,Albert J R Heck.Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics . PROTOCOLS, 2009, 4(4), 484-494 |
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指导教师 意 见 |
指导教师签名： 年 月 日 |
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教研室意见 |
学院意见 |
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教研室主任签名： 年 月 日 |
教学院长签名： 年 月 日 |
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资料编号：[371328]
