- 课题研究背景
白花前胡（Peucedanum Praeruptorum Dunn），又名前胡、鸡脚前胡、官前胡、山独活。伞形科，前胡属多年生直立草本植物。主要分布于我国安徽、浙江、湖北、贵州、河南、湖南、江西和成都等的1000-2000海拔的向阳多山地区[5]。目前市场上的主流来源是产自浙江安徽的宁前胡，产自其他地方的为信前胡。2005版药典起明确规定中药前胡为白花前胡的干燥根[2]。最早记载于陶弘景所著的《名医别录》。性微寒，味苦，辛。具有疏散风热、降气化痰等功效。临床多用于风热感冒、咳嗽痰多、痰热喘满、咯痰黄稠等症[1、5]。主要方剂为前胡汤，在唐代以前被用于治疗肠胃疾病，唐以后则主要作为化痰止咳平喘药来使用。治疗哮证和肺热喘嗽证疗效显著[3-4]。现代药理学研究表明白花前胡有抗炎、降压、抗心衰、抗心脑缺血、抗氧化、平喘、抗菌、神经保护、抗癌、抑制血小板聚集等作用[1、5、6]。
除挥发油类对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等有明显抑制作用[7]，白花前胡的诸多药理作用基本都与香豆素类化合物相关[6]。香豆素(coumarin),即苯并alpha;-吡喃酮,可视为邻羟基肉桂酸的内酯, 最早是从豆科植物香豆中提取得到，具有强烈的芳香甜味。广泛存在于芸香科、伞形科、菊科、豆科、瑞香科、桑科、茄科等高等植物中,在动物及微生物代谢产物中也有存在[9-11]。一般根据环上取代基及其位置的不同,将香豆素分为简单香豆素、呋喃香豆素、吡喃香豆素和其他香豆素等。实验研究发现香豆素类化合物具有抗病毒、抗肿瘤、抗心律失常、抗炎镇痛及抗菌等多种药理活性，具有潜在的药用价值，其中抗肿瘤作用是一个研究热点 [8]。此外，部分天然存在的简单香豆素和吡喃香豆素对HIV有较好的抑制作用[12]。
研究表明，PT决定角型或线性香豆素的生成，通常认为该酶是香豆素生物合成途径上的关键酶。在这一阶段中，异戊烯基转移酶分别在6位或者8位加上异戊烯基基团而决定最后形成线型还是角型化合物[9、13]。本课题将对白花前胡香豆素合成和分类的关键酶——异戊烯基转移酶进行深入研究，对其进行克隆和功能验证。
- 课题研究意义
在香豆素的生源合成途径中，异戊烯基转移酶（PT）控制了及其关键的一步反应。PT可以催化伞形酮使之异戊烯基化，异戊烯基加在C6位生成伞形酮C6位异戊烯基产物（DMS）,加在C8位则生成伞形酮C8位异戊烯基产物（欧芹酚）。而DMS和欧芹酚分别是线性香豆素和角状香豆素的前体[9、13]。虽说早在30年前科学家便开始探索香豆素的生物合成[14]，但植物香豆素异戊烯基转移酶的研究进展缓慢。直到2014年，才从伞形科植物欧芹克隆得到一条PT基因（PcPT），主要催化生成DMS，存在少量欧芹酚 [13]。2016年出现首例从单一的植物物种中发现涉及到合成防御性化合物的一个互补的异戊烯基转移酶对（PsPT1和PsPT2）,PsPT1特异性催化生成DMS，而PsPT2主要催化生成欧芹酚[9]。本课题克隆白花前胡中的PpPT-1，PpPT-2基因，将其构建到pGWB502载体上，转入到烟草瞬时表达系统，并提取蛋白质，进行体外酶活力及Km值测定。异戊烯基转移酶决定香豆素为线性还是角状构型，研究PT的克隆可以对香豆素的产生进行调控，实现定向生产，具有重要理论意义及实际应用价值。
- 课题研究内容
- 相关文献综述
过去前胡用药有白花前胡和紫花前胡两种来源，2005年后药典规定只能取自白花前胡，姜长玉等人发现白花前胡的根断面不整齐呈淡黄白色; 淡黄色皮部居多且散有多数棕黄色油点, 黄棕色木质部含放射状射线，有甜味; 而紫花前胡根断面类白色，皮部较窄，油点少，放射状纹理不明显，无甜味[2]。
熊永兴等人通过对我国药用植物白花前胡的调查发现其主要分布在我国安徽、浙江、湖北、贵州、河南、湖南、江西和成都等的1000-2000海拔的向阳多山地区的山坡林缘，路旁或半阴性的山坡草丛中[5]。
白花前胡主要成分包括主要的化学成分是香豆素类化合物,关注较多的有白花前胡甲素、白花前胡丙素、白花前胡丁素和前胡香豆素类，此外还包括挥发油类、菲醌类、苷类、有机酸类以及甾醇类化合物。香豆素类药理活性主要有心肌保护、扩血管、降血、钙拮抗作用和祛痰作用等；挥发油类中beta;-榄香烯具有明确的抗肿瘤作用、镇痛作用和抗凝血作用，alpha;-蒎烯则通过抑制胞壁中多糖成分及胞膜上麦角固醇的合成,导致菌细胞破裂而起到抗真菌作用；另外没食子酸具有抗肿瘤、杀锥虫、抗病毒等作用，是抗HBsAg和抗HBeAg有效的药物[6]。
孔令义等人利用气质联用对白花前胡挥发油进行研究,从气相色谱图中发现,香木兰烯、beta;-榄香烯等倍半萜为主要成分，beta;-榄香烯对ECA、ARS等两种腹水型移植性动物肿瘤有明显抗肿瘤作用，白花前胡挥发油中未发现紫花前胡挥发油中主要成分爱草脑和柠檬烯[7]。
香豆素类化合物具有抗肿瘤、抗菌和抗微生物、抗病毒、抗炎镇痛及抗心律失常等多种药理活性，具有潜在的药用价值，其中抗肿瘤作用是一个研究热点。虽然香豆素类化合物具有多种药理活性，但还具有一定的生理毒性。药理活性方面，现在国内研究多数是植物(绝大多数为中药) 提取物中香豆素类化合物的定性或定量分析。而国外的文献则偏重于研究香豆素类化合物作为药物在生物体中的药理毒性和代谢机理[8]。
Munakata等人从同为伞形科的植物欧洲防风草（Pastinaca sativa）中得到2条不同的PT基因（PsPT1和PsPT2），制备防风叶微粒体通过HPLC分析发现欧防风中的UDTs有利于DMS的形成，而不是欧芹酚；同时对欧防风中cDNA进行鉴定发现与欧芹UDT-PcPT存在较高同源性，计算机分析证明PsPT1和PsPT2酶都具有多个相似的跨膜结构域；将克隆的PT基因在烟草植株中成功表达并进行体内分析和体外功能表征，结果表明PsPT1和PsPT2是在MeJA应激下诱导的，PsPT1特异性催化生成DMS，而PsPT2主要催化生成欧芹酚[9]。
