重组Reg4蛋白在小鼠胰腺炎模型中的治疗作用及其机制研究文献综述

姓名

吴铭渊

学号

1144417

专业

生物工程

指导教师

王旻

课题名称

重组Reg4蛋白在小鼠胰腺炎模型中的治疗作用及其机制研究

课题性质

radic; 基础研究 应用课题 设计型 调研综述 理论研究

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

[拟研究或解决的问题]

本实验旨在用基因工程的方式对Reg4蛋白进行提取和分离纯化，同时对小鼠进行胰腺炎造模，并研究重组Reg4蛋白在小鼠胰腺炎模型中的治疗作用及其机制。

1. 重组Reg4蛋白包涵体提取、纯化及复性
2. 重组Reg4蛋白包涵体的定性定量检测

3.胰腺炎小鼠模型的构建

4.重组Reg4蛋白在胰腺炎小鼠模型中是否存在保护治疗作用的探究

[采用的研究手段]

1. 重组Reg4蛋白的表达和分离纯化

1.1重组Reg4蛋白的诱导表达和初步鉴定

将含有Reg4蛋白表达质粒的大肠杆菌以IPTG 37℃诱导表达，表达蛋白主要以包涵体形式存在。

1.2重组Reg4蛋白的提取

将细菌培养液冷冻离心弃上清，加入细菌裂解液I，并加溶菌酶，PMSF，DNA酶进行处理后进行超声破碎，离心，弃上清，用细胞裂解液II Triton-100和双蒸水进行多次洗涤离心后，沉淀用尿素溶解。

1.3包涵体蛋白纯化

1.3.1亲和层析

用双蒸水冲洗层析柱后，用尿素上样缓冲液进行平衡，然后将蛋白样品用滤膜进行过滤后进样。再用8M尿素冲洗杂蛋白，然后梯度洗脱。

1.3.2透析复性

将纯化过的蛋白样品装入处理后的透析袋中，逐步降低外液中尿素的浓度并辅以还原型及氧化型谷胱甘肽帮助蛋白正确折叠，进行透析复性。

1.4重组蛋白的检测

1.4.1 SDS-PAGE

1.4.2Western Blot检测

1. 重组Reg4蛋白的体内活性鉴定

2.1胰腺炎模型的构建及重组Reg4蛋白对其的保护作用

2.2对小鼠腹腔注射Arg进行造模

2.2.1监测造模进程

2.2.2胰腺炎模型中Reg4的表达量

2.2.3运用免疫组化评价造模结果

2.3尾静脉注射Reg4给药

2.4摘眼取血及组织摘取

3.Reg4蛋白治疗胰腺炎小鼠的指标

3.1.血清淀粉酶活性测定：

48T小鼠淀粉酶ELISA试剂，微孔内包被有纯化的抗小鼠血清淀粉酶抗体，抗体是用HRP标记，将待测血清加入微孔内，淀粉酶与其抗体相结合，形成抗原-抗体-酶标记复合物，将复合物洗涤后加入TMB，TMB是一种显色底物，其在HRP催化作用下可将复合物转变成蓝色，最后加入终止液硫酸，复合物会转变成最终的黄色。应用酶标仪在450nm处测量其OD值，淀粉酶的浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求得淀粉酶的浓度。

3.2.血清CRP的测定：

固相载体的制作时用纯化的抗体包被微孔板而制成。将实验标本或标准品，生物素化的抗CPR抗体，HRP标记的亲和素一次加入至包被抗CRP抗体的微孔中，然后经过彻底洗涤后用底物TMB显色。具有催化作用可将TMB转化成蓝色，最终TMB在酸的作用下转化成黄色。待测样品中CRP的含量与最终反应物的颜色深浅呈正相关。通过450nm波长的酶标仪来测定吸光度(OD值），计算样品浓度。

3.3.血清脂肪酶活性测定：

用酸价作指标，用95%乙醇作终止剂，通过酸价的测定反映脂肪酶分解脂肪的程度，从而求得酶活力。

3.4.肉眼观察小鼠体内变化：处死小鼠后肉眼观察小鼠腹腔内胰腺的变化，观察是否有腹水和积液，胰腺体积是否增大，水肿。

3.5.组织病理学检查：处死小鼠后迅速取出胰腺，4％多聚甲醛固定，石蜡切片，HE染色，光镜检查及胰腺炎组织学评分。

[文献综述]

重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是临床常见的急腹症，其发病急、病情进展快，并发症多，目前病死率仍高达30％。近几年研究显示SAP时肠黏膜屏障功能受损，容易发生肠屏障功能障碍(intestine barrier functional disturbance，IBFD)，使肠黏膜通透性增加，是导致肠道细菌及内毒素发生移位，加速败血症的进程，诱发和加重全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)、多器官功能障碍综合症(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS)，甚至会引起死亡，因此在治疗原发病的同时对肠黏膜屏障的保护至关重要。近年来胰岛再生源蛋白(regenerating islet-derived protein, Reg)在SAP发生发展过程中的作用日益引起广泛关注。

Reg4蛋白是近几年发现的一类多功能分子，属C型凝集素超家族，大量研究表明Reg4蛋白在多种生理、病理活动中发挥重要作用，在SAP发生发展过程中与促进细胞增殖、调控细胞凋亡、抑制炎症因子过表达及抑制损伤部位周围病原微生物生长和扩散等功能有关，尤其再生基因RegI、III在急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）中的作用日益受到重视，现已有研究表明Reg4可通过抑制NF-kappa;B入核来调节TNF-alpha;、IL-6等诱导的炎症因子的过表达从而抑制炎症的发生，还有研究显示IL-22可以调节Reg4的表达，来抑制损伤部位细菌生长，但其在SAP时肠黏膜损害中的作用研究甚少。

为了探讨急性胰腺炎的饮食防止措施，迫切需要建立一种理想的急性胰腺炎动物模型。目前诱导急性胰腺炎动物模型的方法有十二指肠闭袢和逆行性胰管注射5%牛磺胆酸钠等，这些方法需对动物进行外壳手术，操作复杂，损伤大。而腹腔、静脉注射蛙皮素诱导急性胰度不一致。故人们一直在探索一种操作简单，病理变化典型的急性胰腺癌模型。

[参考文献]

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[2]赵秋玲，黄承钰，徐家玉.L-精氨酸诱导小鼠急性坏死性胰腺炎模型的简历.疾病控制杂志2004年4月第8卷第2期

[3]高云，唐霓，余崇林.PDTC对实验性重症急性胰腺炎肺损伤的保护作用.中国医疗前沿.2012(15)

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