拟研究或解决的问题：
本课题拟考察Blebbistatin能否有效抑制缺氧诱导HUVECs细胞中TF的活性与表达，并初步探讨可能的作用机制，为Blebbistatin在调节内皮功能紊乱上提供一定的实验参考依据。
采用的研究手段：
（1）制备缺氧诱导HUVECs细胞TF表达模型
HUVECs细胞，以1times;106 cell/mL的细胞密度接种于96孔培养板（100 mu;L /孔），37 ℃ 、5% CO2培养24 h。1640培养基同化1 h。 MTT法考察不同时间（2、4、8 h）细胞活力。
HUVECs细胞以4times;105 cell/mL的细胞密度接种于60 mm dish，37 ℃、5% CO2培养24 h。
1640培养基同化1 h后，考察不同缺氧时间（2、4、8 h）下TF蛋白表达。PBS洗涤2次，等量加入细胞裂解液后，提取HUVECs细胞蛋白，4 ℃裂解30 min。离心收集上清液。用BCA蛋白试剂盒测定蛋白含量。剩余的裂解液按1/5的体积加入6times;loading buffer煮沸5 min。10% SDS-PAGE分离样品蛋白并转移到PVDF膜，膜由3%牛血清白蛋白（BSA）封闭并孵育相应的一抗，4 ℃过夜。室温孵育相应的二抗2 h。由化学发光系统（ECLplus, Amersham）检测蛋白条带。
- 改良的发色底物法测定TF活性
HUVECs细胞以1times;106 cell/mL的细胞密度接种于96孔培养板（100 mu;L /孔），37 ℃、5% CO2培养24 h。1640培养基同化1 h后，Blebbistatin （0.01、0.1、1 mu;M）预处理HUVECs细胞1 h后，缺氧条件下作用4 h。吸去培养基，加无血清1640培养液100 mu;L，－70 ℃至室温反复冻融3次，使细胞裂解，将裂解液吹打均匀，吸取45 mu;L接种于另一新的96孔板中，37 ℃温育5 min，加入新配制的人凝血酶原复合物（PPSB）溶液（5 mu;L/孔），37 ℃温育15 min，再加入新配制的发色底物溶液50 mu;L，温育5 min，用酶标仪在405 nm测定吸光度。
- Q-PCR法测定TF mRNA的表达
HUVECs细胞以4times;105 cell/mL的细胞密度接种于60 mm dish，37 ℃、5% CO2培养24 h。1640培养基同化1 h后，Blebbistatin （0.01、0.1、1 mu;M）预处理HUVECs细胞1 h后，缺氧条件下作用4 h，提取mRNA。采用Q-PCR的方法考察Blebbistatin对缺氧诱导的内皮细胞中TF mRNA表达的影响。
- Western法测定TF的表达
HUVECs细胞以4times;105 cell/mL的细胞密度接种于60 mm dish中，37 ℃、5% CO2培养24 h。1640培养基同化1 h后，Blebbistatin （0.01、0.1、1 mu;M)预处理HUVECs细胞1 h后，缺氧条件下作用4 h。PBS洗涤2次，等量加入细胞裂解液后，提取HUVECs细胞蛋白，4 ℃裂解30 min。离心收集上清液。用BCA蛋白试剂盒测定蛋白含量。剩余的裂解液按1/5的体积加入6times;loading buffer煮沸5 min。10% SDS-PAGE分离样品蛋白并转移到PVDF膜，膜由3%牛血清白蛋白（BSA）封闭并孵育相应的一抗，4 ℃过夜。室温孵育相应的二抗2 h。由化学发光系统（ECLplus, Amersham）检测蛋白条带。
