|
开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字） 一、拟解决的问题 本课题希望通过运用相应面法，对现有的放线菌基础培养基进行优化，包括氮源、碳源、无机盐等培养基自身因素和温度、转速等外界培养条件因素，以使得最终酶抑制剂的产量较原始培养基有所上升，达到提高产量、节约成本的目的。 二、采用的手段 （1）单因素实验法 （2）PB实验法 （3）最陡爬坡实验法 （4）响应面曲线法试验 三、文献综述 1、响应面法的定义及优势 利用微生物发酵生产各种有用代谢产物，其培养基成分种类繁多，各成分间的相互作用也错综复杂。因而，微生物培养基的优化工作就显得尤为重要，数学统计中的多种优化方法已开始广泛地应用于微生物发酵培养基的优化工作中，其中以响应面方法的效果最为显著。响应面法(Response Surface Methodology,简称RSM) 是采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系, 通过对函数响应面和等高线的分析, 能够精确地研究各因子与响应值之间的关系, 寻求最优工艺参数, 解决多变量问题的一种统计方法。通常优化发酵培养基的方法是单次单因子法和正交试验设计法。采用单次单因子法时，只是讨论一种因素的影响，由于考察因素间经常存在交互作用，使得该方法并非总能获得最佳的优化条件。正交试验设计则注重如何科学合理地安排试验，可同时考虑几种因素，寻找最佳因素水平组合，但它不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式即回归方程，从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。因此，人们期望找到一种试验次数少、周期短，求得的回归方程精度高、能研究几种因素间交互作用的回归分析方法，响应面分析方法则在很大程度上满足了这些要求。 响应面法可用在描述单个试验变量对响应值的影响、确定试验变量之间的相互关系、描述所有试验变量对响应值的综合影响。RSM 是一种适用性强的试验设计方法,不仅包括试验设计、建模、因子效应评估以及寻求因子水平最佳操作条件等功能, 而且具有数据统计处理功能, 显示出了其它试验方法如正交试验、因子试验、田口试验方法等所不具备的优点, 该法不但具备试验次数少, 周期短、精度高等优点, 而且可以建立连续变量曲面模型; 同时, 对影响试验指标的各因子水平及其交互作用进行优化和评价, 可快速有效地确定多因子系统的最佳条件。RSM在优化研究中应用频繁，是降低开发成本、优化加工条件、提高产品质量、解决生产过程中的实际问题的一种有效方法，它已广泛地应用于农业、生物、食品、化学、制造等领域。 2、响应面法在培养基优化中的试验设计 （1）利用单因素实验确定影响因素。通过改变单个发酵条件，并与基础培养条件进行比较，确定可能的影响因素。 （2）利用Plackett-Burman（PB）法确定主要影响因素。PB法是一种近饱和的2水平试验设计方法。它基于非完全平衡块原理，能用最少试验次数估计出因素的主效应，以从众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素供进一步研究。 （3）最陡爬坡法确定主要影响因素的水平: 响应面拟合方程只在考察的紧接邻域里才充分近 似真实情形，在其他区域，拟合方程与被近似的函数方程毫无相似之处，所以要先逼近最佳值区域后才能建立有效的响应面拟合方程。最陡爬坡法以试验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，能快速、经济地逼近最佳值区域。 （4）响应面曲线法试验：确定试验点, 通过统计分析软件, 寻求最佳的试验条件以及因素间的交互作用。作出发酵条件的响应面图，相应面图的最高点即为所寻求的最优条件。 3、响应面法应用的实例 黄丽金等采用RSM 对唾液链球菌嗜热亚种增殖培养基进行了优化。以MRS 培养基作为基础培养 基, 采用PB 设计法, 对12 种乳酸菌生长促进因子以及培养基的初始pH等13个因素对唾液链球菌嗜热亚种STX2生长的影响进行评价。筛选出CaC12、豆粕水解液、pH 为STX2 的生长强化因子, 然后用响应面分析法确定强化因子的最佳浓度以及最佳的培养基初始pH 值。在优化培养基中, STX2 的菌体浓度达到6.8（ |
10^8）cfu/ mL, 比优化前的1. 5 （10^8）cfu/ mL 提高了4. 5 倍。赵颖等采用RSM 对类胡萝卜素产生菌红酵母的液体发酵培养基进行了优化。用PB 方法确定主要影响因素为酵母膏、硫酸铵和蔗糖。经中心组合试验及响应面分析优化, 得到优化发酵培养基组成为: 酵母膏4.173 g/ L,(NH)2SO4 13.594g/ L, 蔗糖60.533 g/ L, MgSO4 0.3g/L,K2HPO4 0.10g/ L, 核黄素0.004g/ L。在此条件下红酵母产类胡萝卜素的最大产量为15. 291 mg/ L, 较原始培养基提高了58. 65%。王亚军等[ 20] 采用RSM 优化面包酵母培养基, 通过响应面法建立了生物量和蔗糖、硫酸铵及酵母浸出物浓度之间关系, 优化最佳发酵培养基: 115.5g/L 蔗糖, 10.0g/ L 硫酸铵, 25.0g/ L 酵母浸出物。
四、实验基本方案
首先对放线菌菌种进行培养，对培养后的菌种进行单因素实验，通过改变一项发酵条件并于基础培养基进行比较，确立影响因素，再依据PB实验确立主要影响因素。后通过最陡爬坡发确立主要影响因素水平后，最终通过响应面曲线实验得出最佳培养条件。
五、课题可行性分析
响应面法一直以来都是培养基优化的主要方法之一，有着较成熟的技术和较多的成功案例，实验室自身的设备条件等等也完全可以满足该课题，加之时间充裕，因此该课题的可行性较大。
参考资料：
[1] 王永菲, 王成国. 响应面法的理论与应用[J]. 中央民族大学学报( 自然科学版) ,2005,14(3):236.
[2] 诸景光, 罗立新.基于响应面法的Epothilone发酵优化[J] .现代食品科技,2009,25(7):771
[3] 郝学财,余晓斌,刘志钰,等.响应面方法在优化微生物培养基中的应用[J].食品研究与开发,2006,27:38-41
[4] 顾骏,叶蕊芳,郑黎.他克莫司发酵培养基的响应面优化设计[J].工业微生物2008,38(2):06-36
[5] 慕运动.响应面方法及其在食品工业中的应用［J］.郑州工程学院学报。2001，22(3)：91- 94.
