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选题名称 |
蒲公英抗氧化与抑菌的物质基础 |
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研究的目的 及意义 |
蒲公英为菊科多年生草本植物蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.）的干燥全草，别名黄花地丁、婆婆丁和奶汁草等，性寒，味苦、甘，是我国一味重要且常用的清热解毒类中草药，在世界上其他很多国家也药用。 现代药理研究表明，其具有抗氧化性、抗菌和抗炎等多种作用。因此，本文通过抗氧化活性和抑菌（革兰氏阴性、革兰氏阳性及霉菌等）活性进行体外初步筛选来获得抗氧化性和抑菌性强的主效部分或单体化合物，提高蒲公英资源的附加值。 |
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国内外同类 研究概况 |
国内外单独对蒲公英活性组分研究很少，除已发表的一些文献报道了蒲公英的主要活性物质含有机酸、酚酸类和黄酮类等化合物显示出的多重炎症介质抑制作用，同时还有报道称蒲公英叶中矿质元素及萜类化合物的研究之外，对蒲公英的抗氧化和抑菌作用的物质的鉴定及筛选等研究甚少。本课题通过测定不同极性溶剂下获取的提取物的抗氧化及抑菌能力变化，筛选出最强抗氧化和最高抑菌的提取物，并鉴定出主要活性组分，为蒲公英的加工提供实践理论依据，还通过不断试验优化和选择实验方案，最终得出蒲公英抗氧化与抑菌的主要成分。 |
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研究内容 及计划 |
一、研究内容 蒲公英提取物的提取得率、ABTS 自由基、羟基自由基、革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌及霉菌抑菌圈与试管二倍梯度稀释法等测定方法的试验。 二、研究计划 第一阶段 1—3周：开题，查资料，确定测定方法并进行预备实验 第二阶段 4—7周：蒲公英中各功能成分的提取和测定 第三阶段 8—12周：蒲公英中各功能成分抗氧化性与抑菌物质的测定分析及比较 第四阶段 13—16周：论文撰写与答辩 |
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特色与创新 |
对蒲公英提取物中的活性成分进行实验探索，筛选出最强抗氧化和最高抑菌的提取物，并最终鉴定出蒲公英抗氧化与抑菌的主要成分，提高蒲公英的综合利用率。 |
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指导教师 意 见 |
指导教师签名： 年 月 日 |
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文献综述
- 蒲公英及其活性物质的研究现状
蒲公英为菊科多年生草本蒲公英属植物的干燥全草，广泛分布于我国东北、华北、西北、华中及西南各省区，其别名有蒲公草、蒲蒲丁、婆婆英、黄花地丁、 白鼓丁、奶汁草等。显著特征为所开的蒲公英花为花葶状，其实质上为花序梗而无叶，而非花茎，且地表以上通常无叶，无茎。蒲公英属花葶直立且中空，着生大量蛛丝状丝柔的细软绒毛，花序为头状花序数十朵到上百朵，花为舌状两性花，具五雄蕊，筒状花药聚合，花柱细长，伸出雄蕊外，柱头二裂，果为瘦果。
蒲公英是药食兼用的植物，其药昧苦甘、性寒、无毒，入肝、胃经。具有清热解毒、消肿散结、止痛散瘀、养阴凉血、舒筋固齿、通乳益精、利尿通淋、缓泻健胃、保肝利胆、增强免疫和防癌抗衰等功效[1]。目前主要用于临床上治疗痤疮、急性结膜炎、急性乳腺炎、急性扁桃体炎、急性支气管炎、急慢性阑尾炎、鼻炎、咽炎、胃炎、消化性溃疡、胆石症、泌尿系统感染、阴道炎、流行性腮腺炎、感冒以及癌症等多种疾病[2，3]。
蒲公英的主要化学成分包含果胶类物质，菊糖等多糖，三萜类，类黄酮物质，香豆精类，倍半萜内酯类，甾醇，乙酰酯类，色素和挥发性油脂等。目前有关于蒲公英的研究更多集中于中药学领域内，特别是我国药用蒲公英和其加工工艺，蒲公英的热水提取物等不同物质的化学成分探讨，通过对于蒲公英及其提取物的研究可以进一步探讨有关于蒲公英的抗氧化和抑菌作用。
由于蒲公英还富含有蛋白质、脂肪、碳水化合物、多种维生素和微量元素，尤其是含有丰富的硒、铁、钙等人体所需的矿物质，所以也具有研制绿色营养保健食品的开发价值和应用潜力。
- 不同组织的研究现状
蒲公英不同部位的抗氧化成分变化较为明显，尤其是叶、花、花托、籽在每个生长期中抗氧化成分都很高，与其它部位的区别显著。
蒲公英不同部位提取物均有一定的抑制作用，但蒲公英叶的各段提取物均较根多，抑菌效果也更明显，而全草效果最优。全草中绿原酸、黄酮类、有机碱等抑菌成分比根部多，根部主要含有醇类、树脂、橡胶等成分[4]。并且蒲公英的地上部分更有利于生物碱、有机酸和甾类等次生物质的形成和积累[5]。
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蒲公英的化学成分
- 三萜类
三萜类化合物是由数个异戊二烯去掉羟基后首尾相连构成的物质。大部分为30个碳原子，少部分含27个碳原子的萜类化合物，多数通式为（C5H8）6。
三萜类物质是传统药用植物蒲公英中一类成分, 现已发现8种：1938年英国学者从蒲公英中得到了4种五环三萜化合物，蒲公英醇，蒲公英赛醇，蒲公英甾醇，psi;-蒲公英甾醇，beta;-香树脂醇；1941年从中分离出另一种五环三萜醇山金车二醇；1967年又有3种萜醇被分离出来：环菠萝蜜烯醇，环菠萝蜜烷醇，31-去甲环菠萝蜜烷酵[6]。研究表明蒲公英三萜类物质具有良好的抗炎作用，对多种炎症模型都有明确的防治作用外,还可抑制LPS诱导的炎症相关诱导酶类的合成以及多种炎症介质的释放。在抗炎的分子机制方面，蒲公英三萜类物质可显著抑制脂多糖(鹏)诱导的MAPKs通路和NF—KB通路的激活。综上表明蒲公英三萜类物质是蒲公英抗炎的重要成分[7]。
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- 黄酮类
黄酮类化合物是一类广泛存在于自然界的植物中，具有2-苯基色原酮结构，属植物次生代谢产物。它们分子中有一个酮式羰基，第一位上的氧原子具碱性，能与强酸成盐，其羟基衍生物多具黄色，故又称黄碱素或黄酮。黄酮类化合物在植物体中通常与糖结合形成苷类物质，而小部分的是以游离态的形式存在。
黄酮类化合物中有药用价值的化合物很多，这些化合物用于防治心脑血管疾病，如能降低血管的脆性，改善血管的通透性、降低血脂和胆固醇，防治老年高血压、脑溢血、冠心病、心绞痛、扩张冠状血管，增加冠脉流量。许多黄酮类成分具有止咳、祛痰、平喘及抗菌的活性，同时具有护肝、解肝毒、抗真菌、治疗急、慢性肝炎、肝硬化及抗自由基和抗氧化作用。除此之外，黄酮类化合物还具有与植物雌激素相同的作用。在畜牧业动物生产上，黄酮类化合物的应用能显著提高动物生产性能，提高动物机体抗病力，改善动物机体免疫机能[8]。具有一定的开发价值。
黄酮的提取分离
取干燥蒲公英干粉100g，在乙醇体积分数65%，料液比1:35，超声时间35 min，超声温度60°C条件下，提取4次。然后抽滤，得黄酮提取液[9]。
大孔树脂D101湿法灌柱2/3，保持柱子湿润，在上1/3上样，样品的pH值为3，浓度液料比为 3:1即300 mL，先用蒸馏水洗脱，再用40%一70%的乙醇洗脱，蒸馏水洗脱液弃去，收集乙醇洗脱液，用三氯化铁检验洗脱液成灰绿色时收集，再将洗脱液浓缩得到黄酮浓缩液，将黄酮浓缩液放到100°C恒温水浴锅中加热，得黄酮粗品[10]。根据紫外分光光度计法测量蒲公英黄酮含量[11]。
黄酮的鉴定
样品的提取液在氨水环境中显亮黄色、在三氯化铝存在条件下黄色明显加深，盐酸镁粉反应显黄色，证明样品溶液中含有黄酮类物质。
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- 酚酸类
中药酚酸类成分广泛分布在药用植物中，如忍冬科忍冬属的金银花，蔷薇科的托盘根，菊科的蒲公英、灯盏花,唇形科的鼠尾草,橄榄科的方榄,伞形科的当归、川芎等。这些植物中的各种酚酸类成分具有的药理学活性，如清除自由基、抗炎、抗病毒、免疫调节、抗凝血及抗肿瘤作用已经被越来越多的人所重视。
酚酸的提取分离
准确称取100 g干燥蒲公英粉末,平均放人两个500 mL圆底烧瓶中,按1:14的料液比添加60%乙醇,调节pH值到2,然后置超声波提取器中,超声温度为50°C超声提取50min,取出,抽滤得滤液[12],浓缩滤液使得浓度为料液比1:3,即为300 mL,然后过柱(树脂为DA.201大孔树脂,洗脱液为80%乙醇[13]),用三氯化铁检验洗脱液呈深绿色时收集,收集洗脱液后浓缩得酚酸浸膏。根据紫外分光光度计法测量蒲公英酚酸含量[14]。
酚酸的鉴定
样品提取液三氯化铁实验显污绿色、加入重氮盐试剂（加对硝基苯胺、亚硝酸钠）显红色，证明样品溶液中含有酚酸类物质。
－绿原酸
绿原酸又称咖啡单宁酸，为苯丙素化合物的淡黄色固体。化学名为3-O-咖啡酰奎尼酸(3-O-caffeoylquinic acid)；分子式为C16H18O9，熔点208°C,易溶于乙醇、丙酮，微溶于乙酸乙酯。主要存在于忍冬科忍冬属和菊科蒿属植物中，具有抗氧化、抗菌、抗癌、抗紫外光与辐射、免疫调节等多种药理作用[15]。
绿原酸的提取分离
乙醇回流法提取：提取绿原酸的最佳条件为80 %乙醇，料液比1:30，90°C条件下热回流70 min，绿原酸得率为3.631 %。
大孔树脂法分离：经NKA-II型树脂纯化后所得样品的绿原酸含量为22.17 %，回收率为82.41 %，分离效果良好。
－咖啡酸
咖啡酸又名3, 4-二羟基肉桂酸，化学名为3-(3,4-二羟基苯基)-丙烯酸，分子式为C9H8O10，从咖啡酸的乙醇溶液和浓水溶液中可得到不含结晶水的黄色结晶[16]，从咖啡酸的稀水溶液中可得到含一个结晶水的结晶。分解点为223~225°C(194
°C软化)，易溶于乙醇和热水，微溶于冷水。具有抗氧化、抗肿瘤、抗血小板凝集、升白细胞血小板和脑保护等药理作用。
咖啡酸的提取测定
将蒲公英磨碎，过60目筛,称5.0g，用100ml 60—90°C石油醚在索氏提取器中提取4 h，过滤药渣挥干溶剂。将药渣在正交试验设计条件下进行提取抽滤。提取液回收溶剂至膏状,用lOml去离子水溶解,接着用石油醚萃取以除去部分杂质,然后用氯仿萃取得到咖啡酸乙酯溶液,最后将余液用乙酸乙酯萃取得到咖啡酸溶液。将含有咖啡酸的乙酸乙酯萃取液用甲醇定容至50ml，取1ml用甲醇稀释5倍，用分光光度计在325 m下测定其吸光度值,根据标准曲线计算其浓度，得出咖啡酸含量。
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- 甾醇类
植物甾醇是植物细胞的重要组分，在植物界分布很广，一般以游离状态或与糖形成苷而存在，常与油脂共存，其中油脂可用皂化的方法使其成为可溶于水的钠皂或钾皂，而与不溶于水的不皂化物分离，在不皂化物中就可能含有游离的甾醇。游离的甾醇有较好的晶形和熔点，易溶于亲脂性有机溶剂难溶于水，其苷则能溶于醇。中草药中较重要的植物甾醇有谷甾醇、豆甾醇和菠甾醇。其中beta;—谷甾醇与D—葡萄糖缩合成的苷称为胡萝卜苷，存在于胡萝卜、人参、半夏中。
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- 多糖类
多糖类是构成生命的四大基本物质之一。多糖在抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗凝血、免疫促进等方面发挥着生物活性作用。具有免疫活性的多糖其衍生物常常还具有其它的活性，如硫酸化多糖具有抗HIV活性及抗凝血活性，羧甲基化多糖具有抗肿瘤活性。因此对多糖的研究与开发已越来越引起人们的广泛关注。
多糖的提取制备
将蒲公英根部洗净，切成片，0.25%亚硫酸钠护色30 min[17]；叶和花洗净60°C烘干，粉碎，依次用石油醚和95%乙醇回流脱脂除杂。药渣干燥后加30倍体积的蒸馏水80°C保温3h，提取2次，合并滤液，抽滤，减压浓缩，滤液用Sevag法除蛋白6次，蒸馏水透析48h，浓缩，加95%乙醇使乙醇浓度达到80%，过夜，抽滤得多糖沉淀，分别用丙酮和无水乙醇洗3次，真空干燥，得精制蒲公英多糖。
蒲公英多糖含量测定
多糖含量测定采用苯酚一硫酸法[18]。
- 蒲公英的抗氧化性及测定方法
目前测定抗氧化成分有多种方法，如TEAC法、FRAP法、DPPH法、T-AOC法等。DPPH自由基（二苯基苦基苯肼自由基）是一种稳定的以氮为中心的有机自由基，其CH3OH溶液呈紫色，并在517nm处有强烈吸收，在有自由基清除剂存在时，自由基清除剂提供一个电子与DPPH的孤对电子配对，而使其褪色，褪色程度与其接受的电子呈定量关系，在517nm处的吸光度变小，其变化程度与自由基清除程度呈线形关系，即吸光度越小，自由基清除剂的清除自由基能力 越强[19]。
并且蒲公英的不同生长期、不同部位的抗氧化成分含量也不同。在幼苗期，其抗氧化成分含量的大小：根gt;叶梗gt;叶；在开花期，抗氧化成分含量的大小：花梗gt;根gt;叶梗gt;花gt;叶gt;花托；在结籽期，抗氧化成分含量的大小：叶梗gt;根gt;叶gt;籽[20]。
- 蒲公英的抑菌性及测定方法
蒲公英具有广泛普及的抑菌作用，对革兰氏阴阳性菌、真菌、螺旋体和病毒均有不同程度的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和卡他及溶血性链球菌有较强的杀灭作用[21]。蒲公英的热水煎剂对肺炎双球菌、脑膜炎球菌、白喉杆菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、变形杆菌、痢疾杆菌及绿脓杆菌亦有较强抑制作用[22]。
蒲公英体外抑菌研究常用方法
药敏纸片法（蒲公英抑菌试验中最常用的方法）：在普通营养琼脂培养基基础上高压消毒后，冷却至56℃时加上5%～10%无菌脱纤维绵羊血混匀，倒入培养皿中备用。将细菌用取菌环分别致密接种到血平板培养基上后，以无菌操作将含蒲公英浸出液的直径0.4cm的滤纸片贴到培养基上后，37℃培养24h观察测量抑菌环直径。
二倍稀释法：在第一支无菌试管中放入2倍浓度的液体LB培养基1ml，在其余10支试管中放入液体LB培养基1ml，并取显齿蛇葡萄提取物1ml加入第一支试管中，混合后从中取1ml加入第二支试管的LB培养基中，再取1ml加入第三支试管中，依次进行二倍稀释，最后一支试管中取1ml弃去，使每支试管都含有1ml的不同稀释度药液。在上述含不同稀释度的蒲公英提取物试管中各接种0.1ml适当浓度的试验菌，置35℃恒温箱中培养24h，观察生长情况。
固体稀释法、管蝶法、琼脂打孔法等。
- 小结
本文探讨的是蒲公英的抗氧化与抑菌的物质基础，目前国内外单独对蒲公英的活性组分研究很少，本课题想通过测定不同极性溶剂下获取的提取物的抗氧化及抑菌能力变化，筛选出最强抗氧化和最高抑菌的提取物，并鉴定出主要活性组分，为蒲公英的加工提供实践理论依据，还通过不断试验优化和选择实验方案，最终得出蒲公英抗氧化与抑菌的主要成分。
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资料编号：[77166]
