开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
一、课题背景
1、背景介绍
蛋白质作为重要的生物大分子，是所有生物体维持结构、功能的必需物质。传统的蛋白表达是基于细胞体内，对动植物细胞以及细菌等外源基因的表达。但活细胞内复杂的生化反应使得体内蛋白质的表达收到诸多限制。而无细胞蛋白合成系统(cell-free protein synthesis, CFPS)在很大程度上解决了这一系列问题。CFPS是一种全新的蛋白合成方式，以外源m RNA或者DNA为模板，利用微生物、动物、植物细胞抽取物中的蛋白因子、相关的酶系等，通过添加氨基酸、聚合酶和能量等物质,在体外完成转录、翻译、折叠、后修饰和能量代谢过程。自从Nirenberg和Matthaei[1]［1］ 1961年利用大肠杆菌CPFS发现了密码子以来, 无细胞蛋白表达系统快速高效合成具有生物活性蛋白的特质驱使其不断发展, 已成为生物医药研究中的重要工具。
相较于基于细胞的生物合成系统, CFPS不依赖于细胞结构, 突破传统生物技术的局限, 在蛋白质合成方面具有独特的优势。⑴无细胞系统对毒性物质的耐受能力远高于细胞系统［2］。（2）反应操作简便, 体积微小, 模板形式多样，无需繁杂的下游处理以及产物的活性增加［3］。（3）便于调控反应过程，合成复杂膜蛋白［９］。
2、大肠杆菌无细胞蛋白表达体系
大肠杆菌CFPS［4］缺少翻译后修饰手段，但其蛋白产量高、提取物制备简便、遗传背景清晰, 基因操作简便、能量供应成本低，仍成为目前比较成熟和广泛应用的系统。张绪［10］等采取了添加去污剂和脂质体两种策略在大肠杆菌无细胞体系实现ODR-10蛋白的可溶表达,可溶性ODR-10的表达水平达到100mu;g/mL以上。大肠杆菌在CPFS发展历程中也有着关键作用，为当今可用的众多复杂CFPS系统铺平了道路。
3、非天然氨基酸的嵌入
目前较成熟的方法主要包括两大类，分别是基于天然翻译体系的全局抑制方法及基于正交翻译体系(Orthogonal translation systems, OTSs) 的琥珀抑制、移码抑制、有义密码子再分配及非天然碱基对的嵌入方法［５］。在此，主要介绍琥珀抑制。
在天然翻译体系中，64 个三联密码子中的3 个终止密码子赭石 (UAA)、乳白(UGA) 和琥珀 (UAG) 通常不编码任何氨基酸，而是与释放因子识别，终止翻译过程。但在某些生物体天然翻译机制中，终止密码子可编码特定氨基酸。因此，发展了终止密码子抑制的方法，即用3 个终止密码子编码UNAAs，从而合成非天然蛋白质。但在原核生物中，释放因子1 (RF1) 会特异性识别琥珀密码子 (UAG)，与o-tRNA 产生竞争，从而产生截短的蛋白质，使嵌入效率降低，即RF1［６］效应。但根据已有研究表明，使TAG发生突变，并敲除编码RF１的prfA 基因，可有效提高UNAAS的嵌入效率。
