药用植物内生真菌研究进展
摘要：药用植物内生真菌具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化等多种生物活性。根据国内外开展的有关研究，本文就近年来药用植物内生真菌的多样性、分离鉴定、药用价值及其生态功能功能等做一综述。
关键词：药用植物；内生真菌；多样性；药用价值；活性物质
文献综述
植物是全球生物多样性中至关重要的一部分，也是保障人类福祉的基本资源。药用植物是人们认识和利用的植物资源中，具有特殊的化学成分及生理功能，对人体疾患及动物病害具有保健、治疗作用，或者在农业生产中，具有杀虫、杀菌、除草等功效的各类植物的总称[1]。我国地域辽阔，气候复杂多样，具有丰富的药用植物资源。植物内生真菌是指生活史的某一阶段生活在健康植物组织内部，并不引起宿主植物出现明显病症的一类真菌，包括那些在其生活史的某一阶段营表生的腐生菌，以及对宿主植物暂时没有伤害的潜伏性病原菌和菌根真菌。内生真菌具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化等多种生物活性[2]。本文就近年来药用植物内生真菌的多样性、分离鉴定、药用价值及其生态功能等进行了综述。
1 药用植物内生真菌的多样性
1.1药用植物种类多样性
药用植物是地球生物多样性中重要的组成部分，是人类在长期生产实践中认识和利用的、具有特殊化学成分和药理功效的植物资源的总称[3]。药用植物比中草药的概念更为广泛。我国的药用植物资源种类有上万种。在这些药用植物中，临床常用的植物药材有700多种，其中300多种以人工栽培为主，传统中药材的80%为野生资源[4]。中药材的广泛使用和近现代的开发对多种药用植物资源造成了严重破坏，中药资源的物种和可持续利用引起了国内外的广泛关注，药用植物的保护已经成为世界性课题。
1.2内生真菌种类多样性
内生真菌是指在生活史中的某一个阶段存在于健康植物组织内部，不会引起宿主明显病症或者对宿主造成明显伤害的真菌[5]，包括一些在生活史的某一阶段表面生的腐生菌、潜伏性病原菌和菌根菌。从目前研究过内生真菌的植物来看，植物内生真菌类群的分布受地域、树龄、空气湿度、季节变化、植株高度、气候条件等各种环境因素的影响。不同种类的植物中，内生真菌的种类和数量不同，没有发现药用植物体内不存在内生真菌的现象。可以说，自然界的药用植物中有大量的内生真菌资源有待进一步的研究发现。由于目前我们对内生真菌了解的很少，对植物内生真菌种类的估计可能还比较保守。药用植物内生真菌不但物种多样性丰富，还包含着大量的没有认知的新物种。可以说，自然界的药用植物中有大量的内生真菌资源有待进一步的研究发现[6]。在药用植物资源保护的研究中,药用植物的内生真菌已经成为药用植物资源研究的一个新热点。内生真菌在植物中的分布受组织与年龄结构的影响，某些内生真菌具有一定的宿主和组织偏好性[7]。药用植物内生真菌是植物微生态系统中的重要组成部分，其次级代谢中产生的生物活性物质具有很好的开发利用价值，而且某些药用植物内生真菌具备合成宿主某些代谢产物的能力，说明利用药用植物内生真菌开发新药源具有极大的可能性。
1.3药用植物内生真菌活性物质多样性
普遍存在于药用植物体内的内生真菌具有丰富的多样性，是一类巨大的生物资源，代谢过程中产生的各种活性物质与人们的生产、生活关系密切。例如萜类化合物、生物碱类化合物、苯丙素类化合物、黄酮类化合物、甾体化合物、醌类化合物、糖类物质、有机酸类物质、脂类物质、肽类物质和其它活性物质[5]。药用植物内生真菌产生活性物质一般通过微生物发酵法[8]。生物活性物质在发酵产物中的含量一般不高，因此，在活性物质分离前，应保证菌株的发酵规模，以得到足够的有机抽提物，这是成功分离活性物质的重要保障。此外，内生真菌在发酵培养过程中，通过培养基配方比例的调整或培养条件的改变，所得发酵产物也会有差异。除改变培养条件外，还可以通过改变内生真菌生长条件、用生物技术手段构建工程菌株等方法来提高内生真菌生物活性物质的产量[9]。研究人员认识到世界上药用植物内生真菌可能是人们寻找抗癌药物及其它生物活性物质的重要来源，关于药用植物内生真菌的研究从此不仅仅局限于系统学、生态学、生物多样性方面，从内生真菌的代谢产物中寻找生物活性物质已经逐渐成为研究热点[6]。
2 药用植物内生真菌的分离鉴定
2.1药用植物内生真菌的分离
内生真菌是生物活性次级代谢物的重要来源，所以药用植物内生真菌分离是一个关键而重要的步骤。分离所用的方法应能筛选出植物体内尽可能多的内生真菌，同时能排除表面附生的真菌[8]。目前分离药用植物内生真菌普遍采用的方法是组织块分离法，即在超净工作台的无菌环境下，采用酒精、次氯酸钠等灭菌液对植物组织块进行表面灭菌，在真菌培养基上培养组织块，继而进行内生真菌的分离和纯化，再根据经典形态学方法及分子生物学技术鉴定菌种，并进行生物多样性分析[10]。
2.2药用植物内生真菌的鉴定
内生真菌的鉴定主要基于真菌群体和个体形态特点进行归类和鉴定，肉眼观察菌落大小、颜色、表面特征、质地和生长速度等，光学显微镜或电子扫描电镜观察个体形态的菌丝、子实体、孢子和产孢结构等特征，然后根据真菌鉴定手册进行归类。对于那些在纯培养中既不能生长也不能形成孢子的真菌，就要采用其他方法进行鉴定，如rDNA序列测定[11][12]。形态学鉴定主要根据孢子形态特征，但是，常规人工培养条件下真菌只形成营养菌丝而不产生孢子或其他有性结构，而无法进行分类鉴定。为了解决这个问题，诱导内生真菌产生孢子是必要的。目前诱导孢子的方法主要是利用真菌具有通过产生繁殖体应对外界恶劣环境的特性，人为设置各种恶劣外界环境如低温培养、扫刮菌丝、培养基更换、紫外诱导等，从而达到刺激目标菌株产生应激反应而产生孢子。随着现代分子生物学各种技术手段的逐渐应用，不产孢内生真菌的分类鉴定难题在一定程度上得到了有效地解决。通过利用真菌通用引物或针对特定真菌类型如菌根真菌的特殊引物，研究人员直接从药用植物根、茎、叶内扩增真菌核糖体内转录区序列，鉴定了大部分形态学鉴定困难的内生真菌类群，同时也使得全面研究内生真菌多样性成为可能。特别是近两年，随着高通量测序新技术在药用植物内生真菌多样性研究中的积极应用，人们发现了一部分未培养的内生真菌类群，更能全面地反映出内生真菌的多样性[13]。
