细胞热转变分析技术研究进展
摘要：药物研究的众多方法技术中，都无法直接观察到药物分子与细胞内靶点结合。近些年开发的细胞热转变分析（CETSA）很好的解决了这一难题，在靶点发现和验证领域得到了广泛应用。为药物研究拓宽了新道路。CETSA可以对靶标蛋白的药物靶点进行验证，监测药物转运、活化、脱靶效应、癌细胞株耐药性等，还可以了解药物在组织中的分布情况，为药物设计与优化提供了高价值的研究方法[1]。随着此方法的不断深入研究，它有望成为了体内代谢物研究、蛋白质组学、翻译后修饰等领域研究的有力工具。本文就近几年细胞热转变分析技术在实验研究所做成果做一综述，以期为更好利用CETSA提供参考。
关键词：细胞热转变分析； 靶标参与； 耐药性；工具
一、文献综述
1定义
药物作用效果的监测难题是不能直接在细胞和组织中测定药物结合，而是通过研究下游细胞反应来间接监测。这使得几种药物在高级临床试验中均未通过，后来证明是对细胞内的预期药物靶标没有作用[2]。2013年，瑞典卡罗林斯卡医学院的研究人员开发出了一种可以直接检测药物与细胞内和组织样品内靶标蛋白结合及结合强度的方法——CETSA(Cellular thermal shift assay)。这一方法大大方便的药物靶点测定，提高了药物研发的效率。细胞热转变分析方法利用了当药物分子与目标蛋白质结合时，靶标蛋白质会变得具有更好的热稳定性这一原理。通过对加药处理后提取的细胞或组织蛋白进行梯度递增加热，结合Western-blot技术得到待测蛋白的热稳定性曲线，比较蛋白热稳定性的变化来评估药物分子与靶蛋白的结合作用。因这种方法类似于体外的热漂移实验(TSA)，他们便将其命名为CETSA(cellular thermal shift assay)[3]。还能借助定量质谱技术发现和识别目标分子结合的靶蛋白。该技术能在天然的细胞环境中进行，也无需对目标分子和蛋白进行任何修饰以及标记。其主要原理是：(1) 通过对不同温度下蛋白质折叠程度的测量得到蛋白质的热稳定曲线，从而了解药物和靶标蛋白相互作用的强弱；(2) 保持温度恒定，测定不同药物浓度下的蛋白质热稳定曲线，了解不同剂量药物对靶标蛋白所带来的影响；(3) 保持温度恒定，对不同处理时间的靶标蛋白质绘制热稳定曲线，从而获得药物进入细胞和靶标蛋白进行相互作用的时间[1]。
2药物研究中的应用
2.1药物靶标参与的应用
由于缺乏基本的药代动力学/药效学原理，靶标参与（TE）和药物的表达不充分，且由于未验证预期的药理作用机制，许多候选药物在临床试验中失败了。TE是降低临床试验中高失败率的关键因素之一，因此，从药物发现的初始阶段到临床开发，药物TE测量是关键环节。预期细胞热转变分析（CETSA）有助于在药物开发的所有阶段直接测量细胞内靶标参与。CETSA不仅可以定量评估小鼠外周血中的药物靶标参与度，然后通过使用Ishii T等开发的受体相互作用蛋白1激酶（RIPK1）前导化合物证实动物组织中的靶标参与度。建立的半自动化系统允许使用培养细胞系中的天然RIPK1评估结构-活性关系，并且还可以估计小鼠外周血单核细胞中的药物占用率。而且，优化的组织均质化能够监测脾脏和大脑中的体内药物靶标参与。Ishii T等的结果表明，CETSA方法学将为临床前和临床药物开发提供有效的工具[4]。
