一、研究目的和意义：
单细胞凝胶电泳(Single-Cell gel eiectrophoresis,SCGE) 又称慧星试验(comet assay)是一项新的电泳试验方法.自1978年被Rydcbert B 等人成功地用于检验D N A 单链断裂以来,经过不断的改进, 已成为一种快速、灵敏、简便的检测DNA损伤的方法, 广泛地应用于DNA放射损伤、DNA剪切损伤、DNA交联的检测、药物的毒性评价、细胞凋亡鉴定等工作中。近年来, 越来越多的毒理研究者应用此方法在体内、外对细胞进行DNA损伤诱导,以探讨已知遗传毒物和诱变剂的特异活性。SCGE技术在遗传毒性研究中的应用: ①体外试验理论上, 任何真核细胞都能用于体外单细胞凝胶电泳的遗传毒性研究, 相应的代谢活化系统( 如S9) 是体外单细胞凝胶电泳所必需的。由于细胞死亡也会产生DNA 损伤, 实验设计的关键是受试物最高剂量以不产生过度的细胞毒性为宜,通过活体染料排斥法、细胞计数以及ATP水平等指标来判断有无细胞毒性, 以避免假阳性结果的产生。②体内试验: 彗星实验现已被应用于针对任意器官的体内试验, 较其它常规遗传毒性试验方法有更多的优势。常规实验适用于快速增生细胞( 如骨髓细胞的细胞毒性评价) 和/或仅用于己经确认的单一组织( 如肝脏不规则DNA合成分析)。它主要应用于机理研究的深入分析, 而且对可疑的组织特异性遗传毒性活性研究有重要意义, 这一实验的关键在于组织的选择和剂量的确定。③由于其快速、敏感、重复性好、可应用细胞范围广等优点, 在96孔板上进行彗星实验已成为有发展力的高通量筛选方法之一。今后将彗星实验与FISH技术通过特异的DNA探针可联合用于检测选择性序列、区段和染色体的D N A 损伤, 检测方法将更加快捷、高效。近年来, 以DNA损伤和修复为检测终点的单细胞凝胶电泳试验, 由于其快速、简便、敏感等优点, 越来越受到遗传毒理工作者重视, 在国外遗传毒理学核心期刊上出现频率很高。
- 研究原理和方法：
- 、实验原理：
大的DNA 分子在断裂剂作用下出现单链或双链断裂, 由于DNA 分子在细胞核内形成紧密的超螺旋结构, 检测这些断裂需要将双链DNA 分子解螺旋, 高pH(gt;12 .3)促使DNA 变性和解螺旋从而有利于单链和双链DNA 断片的移动。在电场作用下, DNA 断片向阳极移行, 移动的距离与DNA 断片的分子量和电荷数相关, 经溴乙啶染色后, 在紫外线照射下发出荧光, 使每个受损的细胞均呈现彗星的外观, 明亮的头部为细胞核, 一系列的DNA 断片组成彗尾, 尾巴的长度和荧光强度与诱变剂导致的DNA 断裂数成正比, 未受损细胞只有不动的细胞核(彗核)而无彗尾。
(二)、实验方法：
1、主要仪器
数显电热恒温水浴锅、电泳仪、电子分析天平、荧光显微镜及数码成像系统、匀浆器、磁力搅拌器等。
- 主要试剂
氯化镉（Cdcl2.2.5H2O）,正常熔点琼脂糖（NMA），低熔点琼脂糖（LMA），N-十二烷基肌氨酸钠，Triton-X-100,溴化乙锭（EB），氯化钠，氯化钾，磷酸二氢钾（KH2PO4），磷酸氢二钠（NaH2PO4.12H2O）,
乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）,三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）,氢氧化钠，二甲基亚砜（DMSO),盐酸等。
- 主要溶液的配制
磷酸盐缓冲液（PBS）:Nacl 8g,Kcl 0.2g, NaH2PO4.12H2O 2.9g,KH2PO4 0.2g,无Ca2 ,Mg2 双蒸水1000ml，调节PH至7.4，冰箱4℃保存。
0.5%低熔点琼脂糖（LMA）：0.5gLMA与100ml磷酸缓冲液混合，加热溶解，冷却后冰箱4℃保存备用。
