开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 拟研究的问题
MeCP2(Methyl Cp G bind-ing protein 2)基因突变会导致RTT，目前临床数据显示MeCP2基因突变有70%~80%几率导致RTT，其突变形式包括错义突变、移码突变及大片段缺失等[1]。突变后的MeCP2蛋白结构发生改变，不能正确结合DNA，丧失调控下游基因的能力，导致下游基因表达异常，进而影响神经元发育，引起RTT的不同症状或表型。RTT综合征患者表现为：从出生后6~18个月生长发育基本正常，之后出现发育停滞，头围增长缓慢，并伴有孤独症样行为，继而出现智力障碍和运动能力失调，呼吸不规则等行为。随着年龄的增长，患者会出现严重的智力低下，惊厥发作，失去行走能力等，到后期还可能出现骨骼改变，脊柱侧凸等症状［2］。本课题主要是构建MeCP2基因载体，希望通过这一步骤为后续MeCP2相关蛋白的深入研究提供依据。
- 研究手段
CRISPR/Cas9的作用机理：
当外源DNA入侵细菌时，其免疫系统会就捕获外源DNA，并对其序列进行处理，筛选出区
分度高的片段序列整合到CRISPR基因座中，形成了一段新的重复单元，类似于真核细胞的获得性免疫，而这些重复单元就是细菌特异性免疫的结构基础。需要注意的是，外源DNA的捕获并不是完全随机的，在这些被捕获的DNA序列下游常有一段序列保守的特殊结构，被称为原间区临近基序位点（Proto-spacer adjacent motifs PAM）。该结构只有3个碱基长，但却十分重要，因为它可能是CRISPR系统区分自身DNA与外源DNA而避免发生自身免疫的机制之一，同时也是基因编辑时，靶序列选择的重要要求。之后，如果该DNA在此入侵，与其同源的不完全重复结构就会被表达转录形成RNA，在 RNaseⅢ的作用下折叠。经过一系列的转录后加工，再通过碱基配对与tracrRNA结合，这样具有生物活性的双链RNA结构就形成了，再和Cas9蛋白进一步结合就可以达到识别和降解外源DNA的目的了。根据上述原理，只需合成定制的crRNA，将其插入到合适的质粒中，与分别表达tracr RNA和Cas9蛋白的质粒共转染细胞，或体外转录成RNA后注射到特定细胞中，就可以建立基敲除的细胞系模型［3］。
- 文献综述
基因编辑技术包括同源重组、ZFN（锌指核酸酶技术）、TALENS技术和CRISPR/Cas9技术。其中同源重组技术周期长，耗费人力物力。ZFN（锌指核酸酶)由一系列锌指蛋白和Fok I非特异性核酸内切酶构成，两个ZFN分别结合到靶序列后，激活Fok I使DNA特定位点产生双链断裂，但是ZFN技术存在不能识别任意目标基因序列、识别序列经常受上下游序列影响以及费用昂贵等问题。TALENs由TALE 蛋白和FokI 核酸内切酶组成，利用TALEN 的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化组合蛋白，从而达到识别内源性基因的目的。相比于TALENs技术模块构建复杂，相对而言CRISPR/Cas9系统只需要设计一条sgRNA即可识别靶序列。该技术具有简单易行、周期短、价格低廉等优点。CRISPR/Cas9系统不仅可以对基因组特定位点进行编辑，并且可以同时对多个靶位点进行编辑。
参考文献
- Bhanushali AA, Mandsaurwala A, Das BR. Homozygous c. 1160Cgt;T (P38L) in the MECP2 gene in a female Rett syndrome patient. J Clin Neurosci,2016,25:127-129.
- Kishi N,Macklis JD.MECP2 is progressively expressed in post-migratory neurons and is involved in neuronal maturation rather than cell fate decision.Mol Cell Neurosci,2004,27(3):306-321
- Wei Zhai,Hongxiu Hu,Liang Le,Generation and analysis of the Rett syndrome-associated Mecp2-null rat model.Hereditas,2016,38(11):1004-1011
