|
课题名称 |
酶法合成BOC-（R）-3-氨基-4-（2，4，5-三氟苯基）丁酸 |
|||
|
课题来源 |
教师命题 |
课题类型 |
应用研究 |
|
|
课题的背景、目的和意义 |
西他列汀(Sitagliptin) 为二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制药，通过保护内源性肠降血糖素和增强其作用而控制血糖水平。葡萄糖依赖性促胰岛素释放肽(GIP)和胰高血糖素样肽-1(GLP-1)，是针对膳食摄入而释放的肠降血糖素。西他列汀抑制肠降血糖素经DPP-4的降解，故能增强GLP-1和GIP的功能，增加胰岛素释放并降低循环中胰高血糖素水平。(R)-N-BOC-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸(I)是合成西他列汀的关键中间体。目前合成(R)-N-BOC-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸(I)的方法主要有以下几种： （1）以天冬氨酸为原料，利用其中有的手性氨基，通过改造后与2,4,5-三氟溴苯进行偶联，然后适当转化得到(R)-N-BOC-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸(I)。该方法最大的优点是利用了天冬氨酸中的手性氨基，但是此法需要将成本较高的2,4,5-三氟溴苯做成金属试剂，所用的当量数较大，使得该路线成本较高。 （2）以3-氧代-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯(IV)为原料，将其转化成烯胺，通过不对称氢化来构建手性氨基，再适当转化得到(R)-N-BOC-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸(I)。该方法路线虽然简洁，但需要采用不对称氢化反应，其中带手性配体的金属催化剂价格昂贵，不易获得；另外不原称氢化反应得到的产品的手性纯度也很难达到要求，往往还需要进一步结晶提高其手性纯度。 （3）以3-氧代-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯(IV)为原料，将其转化成烯胺，通过普通氢化反应得到外消旋的胺，再通过化学拆分来得到单一的异构体，最后适当转化得到(R)-N-BOC-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸(I)。该方法路线虽然简洁，但需要化学拆分，不仅总收率低，还会产生另一半废弃异构体。[1] 相比之下生物转氨酶法有着收率高、手性值高和环境友好的优势而被推崇。虽然有不少文献报道，筛选到的转氨酶能成功转化底物得到（R）-3-氨基-4-（2，4，5-三氟苯基）丁酸，但是因为底物浓度低（≦20克/升）而无法工业化。 本次课题的目的在于通过筛选和突变得到一种高效的转氨酶，能高效地催化高浓度廉价易得的底物3-氧代-4-（2，4，5）-三氟苯基）丁酸甲酯，从而实现目标产品的工业化生产。 本次课题具有重大的意义。生物酶法合成工艺具有反应条件温和、环境友好、选择性高及反应步骤短等优点,符合“绿色化学”的要求,课题的完成可以使生物酶法技术更加成熟和完善。其中暴露的问题与相应的解决方案可以作为其他酶法制剂的参考协同进步。与此同时BOC-（R）-3-氨基-4-（2，4，5-三氟苯基）丁酸作为一种重要的工业原料，市场对其的需求程度日益增加，酶法合成带来的成本的降低与技术的进步，不仅使得经济效益的大幅增长，而且加强了酶法工艺的竞争力，让产品有了更安全有效的来源，为21世纪——生物世纪的实现做出一份努力。 |
|||
|
课题的理论依据、研究方法与研究内容 |
首先需要建立反应方法和体系。为了测定反应中底物和产物的含量，采用分光光度法。分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。它具有灵敏度高、操作简便、快速等优点，是生物化学实验中最常用的实验方法。许多物质的测定都采用分光光度法。在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与不同波长相对应的吸收强度。如以波长（lambda;）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。[2] 然后需要在酶库中筛选出反应效率最高的转氨酶或氨基酸脱氢酶，可以采用毛细管电泳法。毛细管电泳法以其分离效率高、耗时短、样品用量少、易于实现自动化等诸多特点，特别是高效分离机制，在酶筛选中显示出传统方法无法比拟的优势。而且，毛细管电泳法可以结合多种检测方法，如紫外、激光诱导荧光、质谱、电化学以及辐射检测等进行目标物的分析，其中，紫外检测以其成本低、操作方便、环境友好等优势成为最广泛使用的检测方法。毛细管电泳-紫外检测的灵敏度受到待分析物浓度的限制。通过增加检测光程或样品浓缩富集可提高检测灵敏度，例如改变检测池的几何形状，包括泡形池、Z形池和多次反射池来增加检测光程，以及零电压效应、样品堆积、场放大堆积和场放大进样等浓缩富集技术提高检测的灵敏度。Iqbal 等在监测核苷酸焦磷酸酶和磷酸二酯酶的反应时，在内壁涂层为聚凝胺阳离子的毛细管内，将聚凝胺加到缓冲溶液中，利用产物与聚凝胺电迁移方向相反，使得产物堆积来提高检测灵敏度。也可以通过将样品溶解在水中，或者采用稀释的缓冲液使样品堆积。 毛细管电泳法筛选酶抑制剂主要有4种形式: 柱前酶反应( Pre-capillary enzyme reaction) 、毛细管进样端反应( At-inlet reaction) 、电泳中介微分析( EMMA) 、层流剖面的横向扩散( TDLFP) 技术，其中,At-inlet、EMMA和TDLFP都属于在柱酶反应( In-capillary enzyme reaction) 。[3] 最后通过控制变量的方法，分别以氨基、pH和温度、底物浓度和酶量为变量进行对比实验，找到最适合反应的基本条件。 |
|||
|
预期的结果 |
完成论文《酶法合成BOC-（R）-3-氨基-4-（2，4，5-三氟苯基）丁酸》 |
|||
|
参考文献 |
[1]南京博优康远生物医药科技有限公司. 一种固定化转氨酶及其在合成西他列汀中间体中的应用[P]. 2015-07-29. [2]吴蕾,查春旺;分光光度法检测酶促反应中底物的量[J];科技资讯;2018年16期 [3]刘冬梅,师彦平,陈娟;毛细管电泳法在酶抑制剂筛选中的应用[J];分析化学;2015年05期 [4]叶继丹,卢彤岩,田雷,孙大江;不同pH和温度条件下杂交鲟胃中消化酶活性的变化[J];研究简报;2003 [5]方起鹏;不同底物浓度下一步酶法制备7-ACA含量及转化率的动态变化[J];2013 |
|||
|
进度安排 |
2020.3.5前确定并提交论文课题 2020.3.11-2020.3.19查看任务书并上传开题报告 2、实验阶段 开学第1周建立反应的中控分析方法（同时检测底物和产物）和合适反应体系 开学第2周-第3周测试公司酶库里的转氨酶和氨基酸脱氢酶，筛选出反应效率最高 开学第4周测试不同氨基供体对反应的影响 开学第5周测试不同pH和温度对反应的影响 开学第6周测试不同底物浓度和酶量对反应的影响 3、书写答辩阶段 开学第7周-第8周撰写论文 答辩时间由实习单位选定 |
|||
资料编号：[372442]
